竹屑制备天然防腐剂的工艺优化及抑菌性能研究

胡永乐 张传海 张媛 尤永芳 黄薇 贾小丽

摘要：[目的]为研究竹屑制备天然防腐剂的最优工艺并探讨其抑菌性能。[方法]以竹屑为原料，采用乙酸乙酯回流法，在单因素试验基础上，应用响应面法优化天然防腐剂制备条件，并考察其抑菌活性。[结果]竹屑制备天然防腐剂的最佳工艺条件为超声功率300W、提取温度89℃、液料比20：1、提取时间2h.在此条件下，所得提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和黑曲霉的抑菌效果达到最强，抑菌圈直径分别为：9.33、15.67、10.00、6.67mm，最低抑菌浓度分别为：0.02500、0.01250、0.05000和0.10000g·mL^-1，竹屑天然防腐剂得率为4.77%。[结论]响应面法优化工艺制备的天然防腐剂对4种供试菌抑菌效果良好，制备工艺可行性高。该工艺可为竹废弃物的加工再利用提供参考。

关键词：竹屑;天然防腐剂;响应面分析法;工艺优化;抑菌

中图分类号：7S202.3文献标志码：A 文章编号：1008-0384（1020）02-0226-9

0 引言

（研究意义）中国竹种类丰富多样，竹林面积、蓄积量和产量均居世界之首。第八次全国资源连续清查报告表明，我国竹林面积已达601万hm²，是重要的森林资源之一。材用竹广泛应用于建筑、家具、造纸和工艺品等行业，在竹加工产业中，产生的废弃物约占整个竹产品的60%以上，这些“废料”的丢弃导致竹材的利用率始终停留在35%～40%这一阶段。（前人研究进展）相关研究表明，毛竹采伐剩余物主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，经硫酸盐法成浆后，纸浆得率为44.71%。目前竹屑的资源化利用形式主要有直接利用、传统加工利用和工业化利用，产品主要包括复合材料、生物质燃料、活性炭、食用菌基质和多糖等。此外，竹屑中还含有蛋白质、脂肪、糖、矿物质和多种次生代谢产物，含量因竹种、竹部位、采伐季节以及生长环境而异。从植物的次生代谢产物中获取天然的抗菌成分，一直是国内外天然防腐剂的研究热点。（本研究切入点）天然植物源防腐剂提取工艺复杂、成本高、生产季节性强，是影响其获取和广泛应用的限制性因素。竹屑为竹产业加工的废弃物，且资源丰富，以竹屑为原料制备天然防腐剂应用于抗菌领域的研究鲜见报道。（拟解决的关键问题）以竹屑为原料，采用简便、可行性高的乙酸乙酯回流法制备天然植物源防腐剂，通过响应面法优化提取工艺，并考察其对食品中常见有害微生物的抑制作用。期望本研究结果能为低毒天然植物源防腐剂的研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料与设备

将竹废弃物收集于武夷山竹加工厂，用高速中药粉碎机粉碎，过60目筛，制成竹屑，备用;大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、黑曲霉（Aspergillus niger），均为武夷学院生物工程实验室保藏菌种;乙酸乙酯、硝酸钠和磷酸氢二钾等分析纯试剂，琼脂粉、牛肉膏和蛋白胨等生化试剂，均购自上海麦克林生化科技有限公司。

103B型高速中药粉碎机（永历制药机械有限公司）;BSA 223S电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）;R206D旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）;LG-1002-A型超净工作台（苏州真田洁净设备有限公司）;生化培养箱（上海精宏实验設备有限公司）;KQ-500D型数控超声波清洗器（瑞利仪器分析有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1竹屑制备天然防腐剂的单因素试验 称取5.0g竹屑，在液料比为20：1（mL：g）的乙酸乙酯溶液，超声功率分别为100w、200w、300w、400W的条件下超声1h，于90℃的热水浴中进行2h的回流提取，提取2次。将提取液合并后，在旋转蒸发仪上减压浓缩至黏稠状，将浓缩提取液在真空干燥箱中干燥成粉末后进行称重。分别测定不同功率超声波处理下所得提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和黑曲霉的抑菌效果，计算得率（得率/%=提取所得天然防腐剂干重/竹屑质量×100）。将优选的最佳超声功率作为固定参数，依次进行提取时间（1h、2h、3h、4h、5h），液料比（10：1、15：1、20：1、25：1、30：1），提取温度（60℃、70℃、80℃、90℃、100℃）对制备产物抑菌效果的单因素试验。试验均重复3次，取平均值。

1.2.2响应面法优化竹屑制备天然防腐剂工艺试验在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，在固定功率300w超声1h、提取2次的基础上，选取提取温度、液料比、提取时间3个因素，以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和黑曲霉为指示菌，抑菌圈直径为响应值，对试验结果进行分析。试验因素及水平见表1.

1.2.3 防腐剂抑菌效果的试验与评价 菌悬液的制备：在无菌条件下用划线法分别将保藏的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和黑曲霉菌种接种于相应的固体斜面培养基上，放人培养箱中，细菌在37℃下培养24h、霉菌在28℃下培养48h进行活化。挑取活化好的菌落，用无菌生理盐水lo倍稀释法制得不同稀释浓度的菌悬液，菌落计数调整菌浓度为1×10⁶～1×10⁷CFU·mL^-1，备用。

抑菌圈直径的测定：取配制好的菌悬液各100uL，均匀涂布在相应的无菌平板培养基上。将已灭菌烘干、直径为6.0mm的圆滤纸片放人1g·mL^-1竹屑天然防腐剂溶液中浸泡30min，取出后贴在含菌平板上，以无菌生理盐水作为空白对照。含大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的平板在37℃恒温培养24h，含黑曲霉的平板在28℃恒温培养48h，之后取出测量抑菌圈直径大小，每个抑菌圈在垂直方向上测两次，每个试验重复3次，取其平均值。抑菌圈直径越大，则抑菌效果越好。