框架核酸在活细胞分子诊断和成像中的应用

朱 丹, 张成文, 王子纯, 晁 洁

(南京邮电大学 有机电子与信息显示国家重点实验室/江苏省生物传感材料与技术重点实验室/先进材料研究院(IAM)/ 材料科学与工程学院/江苏省有机电子与信息显示协同创新中心， 江苏 南京 210023)

细胞是生物体结构和功能的基本组成单位，其表面和内部均存在多种生物标志物，如核酸、蛋白、离子等，与细胞信号传导及疾病发生发展过程密切相关.对活细胞进行分子水平的诊断和成像可以提供单细胞内分子标志物的时空差异性和位置多样性，揭示分子标志物在细胞信号传导及疾病发生发展过程中的相互作用关系，已成为研究者关注的热点.由于细胞环境的复杂性，发展能在细胞等复杂生理环境下稳定存在的生物探针，可以有效地提高探针在活细胞内诊断的灵敏度和准确性.框架核酸作为一种具有强大可编程性和良好生物相容性的纳米结构，在活细胞分子诊断和成像中具有广阔的应用前景[1-3].本文对框架核酸在活细胞分子诊断和成像中的应用做一综述.

1 框架核酸概述

1.1 框架核酸的提出与发展

框架核酸是一类由天然核酸通过可精确编程的碱基互补配对方式构建的具有特定框架结构的核酸体系[4].20世纪80年代，美国纽约大学的Seeman[5]用DNA通过碱基互补配对构建了稳定的四臂关节结构，并提出具有n(n≥3)个臂的DNA结构以同样的方式组装可以构成骨架框架的设想，开启了结构DNA纳米技术的时代(图1a)，为框架核酸结构的构建奠定了基础.2006年，Rothemund[6]首次提出了DNA折纸术的概念，通过碱基互补配对作用将一条长单链DNA和多条的短单链DNA“订”在一起，折叠成一定的二维平面图形.该方法可以构造出多种平面图案(图1b)，为框架核酸结构的构建提供了新思路.2018年，樊春海课题组提出了“框架核酸”的概念，首次将这类具有特定空间拓扑结构的核酸体系统称为“框架核酸”结构[4].

目前，通过计算机辅助设计和结构预测，研究者们使用不同的堆叠和组装方式，可以构建多种复杂结构的框架核酸，如多面体结构[7](图1c)、不规则平面结构(如中国地图[8]，图1d)、DNA与金属纳米粒子结合的球形核酸[9](图1e)、DNA盒子[10](图1f)、纳米棒[8](图1g)及DNA四面体[11](图1h)等.这些结构具有良好的单分散性，相比较于无机、有机或聚合物纳米颗粒，框架核酸具有接近原子尺度精度的特性，能够在纳米精度对功能性核酸分子(如核酸适体、核酸酶等)、蛋白或纳米颗粒进行特定位置的精准组装集成，形成具有更多功能的传感检测体系[12-13].与单链或者双链DNA相比，框架核酸具有刚性更强的空间拓扑结构，在保留了核酸固有的生物相容性的基础上，兼具了纳米结构的稳定性和可修饰性，其独特的空间可寻址特性和有序性，为生物诊断提供了新工具，在活细胞分子诊断和成像领域独具优势[14-15].

图1 框架核酸结构的构建

1.2 框架核酸的组装与功能化

框架核酸由DNA或RNA通过“自上而下”或“自下而上”的方式自组装形成.目前，研究者已开发了多种模拟软件用于框架核酸的序列设计和结构预测[16].例如，对于小型结构(如DNA瓦片和DNA基序等)，可使用Sequin[17]或Uniquimer[18]软件辅助序列设计；对于较大的结构(如DNA折纸等)，可使用caDNAno软件进行设计[19]；可使用Daedalus软件进行三维结构的设计[20]等.框架核酸的组装通常以控制温度或变性剂(如甲酰胺、尿素等)浓度的方式调控核酸结构的变性或复性[21-23]，从而达到构建特定杂交结构的目的.由于框架核酸结构中的核酸易于修饰和功能化，因此，可以将多种具有特定功能的核酸结构或纳米材料偶联在框架核酸结构中构建复合结构，赋予结构优异的空间可寻址性及独特的物理化学性质[24-29].如框架核酸结构中的DNA可修饰多种化学基团或分子，又如荧光染料、硫醇、生物素等[30-31]，使之可以在特定位置与纳米材料(如上转换颗粒、贵金属纳米颗粒、量子点等)偶联，形成具有生物识别性能和独特光学性能的复合结构，达到生物检测和信号扩增的目的[30, 32-37].

1.3 框架核酸的表征方法

对框架核酸的形状与结构进行表征是研究框架核酸性质和应用的基础.常见表征方法有凝胶电泳[38]、原子力显微镜(Atomic Force Microscope, AFM)、透射电子显微镜(Transmission Electron Microscopy, TEM)、冷冻电镜(Cryo-electron Microscope，CM)、动态光散射(Dynamic Light Scattering, DLS)、小角X射线散射(Small Angle X-ray Scattering, SAXS)等[39].凝胶电泳是实验室较常用的表征核酸结构大小的方法，通常以聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶为介质.核酸样品在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向移动，其迁移速率与其分子量的对数成反比，因此，可以通过迁移距离推测、比较出核酸分子的大小和构型等.由于样品不需要提前纯化，操作简便易实现，电泳技术应用广泛，但无法直观地观察到框架核酸的结构形貌.原子力显微镜和透射电子显微镜都可以用于框架核酸结构的直观成像.其中，原子力显微镜通过检测样品表面和微型力敏感元件之间极微弱的原子间相互作用力进行样品一维和二维的成像，不仅可以在近自然的状态下静态成像，而且可以通过对样品同一区域连续扫描进行动态的观测，展现出框架核酸在自然状态下的折叠路径[40].但由于自身成像原理的限制，原子力显微镜和透射电子显微镜无法进行三维结构的表征[41].冷冻电镜则很好地弥补了这个不足，它可以在不固定样本和不染色的情况下，对三维物体进行可视化，并且提供对DNA结构深层次的信息反馈，目前已成为框架核酸三维结构最有效的直接观测工具[42].然而，原子力显微镜、冷冻电镜等显微镜在成像过程中可能会对DNA样品造成一定的损伤，改变样品的化学环境甚至结构.因此，小角X射线散射、动态光散射等光学表征手段也被用于框架核酸结构的辅助表征.例如，小角X射线散射技术可用来表征框架核酸的特征轮廓[10]，而动态光散射技术可以测量框架核酸结构在溶液中的粒径分布[43].

2 框架核酸用于活细胞分子诊断与成像

2.1 细胞内核酸标志物的检测

核糖核酸普遍存在于每个细胞中，某些核酸的含量和表达与疾病的发生和发展密切相关，可作为生物标志物用来指示疾病的进程.例如，胃癌组织和细胞中存在许多异常表达的长链非编码RNA(Long non-coding RNA, lncRNA)，如GClnc1、HOTAIR、H19、GHET1等,均被证明与胃癌的发生和发展显著相关[44]；多种信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)在癌细胞中的异常表达，例如TK1 mRNA、survivin mRNA、miRNA-155和miRNA-21等，已被证明与肿瘤的产生与恶性发展密切相关[45-47].分析细胞核酸含量的方法通常以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)为主[48-50]，该类方法通过对组织和细胞裂解处理后，进行目标核酸提取，设计引物探针进行PCR反应，以实现核酸的扩增和检测.但PCR步骤较为繁琐耗时，裂解处理会对细胞造成活性的破坏，仅能检测肿瘤标志物核酸的种类和平均含量，无法提供活细胞内肿瘤标志物的动态变化及表达差异信息.由于框架核酸可以在无转染试剂辅助的情况下直接穿过细胞膜，并有效保护所载带的生物分子长时间抵御生理环境中核酸酶的降解，因此，为活细胞内核酸标志物的检测提供了新的契机[51].

Tay等[52]利用框架核酸优良的生物相容性与稳定性，基于四面体框架核酸构建了一种“纳米蜗牛”(图2a).该四面体一个顶点处延伸出一段能够识别目标mRNA的发卡结构，发卡端部修饰了荧光基团与淬灭基团，荧光被淬灭.当探针进入细胞后，目标mRNA与发卡结构杂交，使发卡结构打开，荧光基团与淬灭基团远离，荧光恢复.在此过程中可保持细胞活性，实现活细胞中mRNA准确、动态的时空分辨检测.Zhou等[53]进一步将两种识别不同核酸目标的发卡结构嵌入框架核酸的臂中，构建了能够同时在活细胞中识别两种miRNA的结构探针(图2b).

在以上框架核酸结构的设计中，核酸的识别模式为1∶1(探针∶目标)的核酸杂交所引起的信号强度变化有限，因此，结合了扩增检测策略的框架核酸探针也被用于活细胞核酸标志物的检测中[54-56].例如，为了提高检测灵敏度，Yang等[57]受自然界中“章鱼触手”的启发，将多个修饰了生物素的三棱柱框架核酸通过亲和素组装在一起，开发了具有多条“触手”的生物探针.为了提高探针进入细胞的效率，他们将三棱柱结构延伸出可识别癌细胞表面核仁素受体的AS1411核酸适体.结构中的“触手”可以识别特定的miRNA，并发生局域等温核酸扩增反应，实现单靶标的循环利用和信号扩增(图2c)，He等[58]构建了两种四面体框架核酸，利于其顶端延伸出的DNA结构单元间的熵驱动链取代反应，实现了活细胞中mRNA的高灵敏检测(图2d).

与其他活细胞检测探针相比，框架核酸易于合成，可以偶联多种生物功能分子，无需转染剂就可以进入活细胞发挥作用，大大降低了实验操作的繁琐程度.例如，金属离子辅助的核酸酶由天然核酸组成，可以有效地实现催化反应和信号扩增，具有高选择性、高灵敏的特点.Xue等[59]将连接有Na+特异响应的DNA酶结构通过杂交方式连接在三角形框架核酸结构上，该结构可通过三角形结构顶点处延伸的AS1411核酸适体提高进入活细胞的效率.细胞中的miRNA可以与封锁DNA酶活性结构的序列杂交，使DNA酶在Na+的驱动下发生特异性水解，释放出大量荧光信号，从而实现活细胞中miRNA的高灵敏检测(图2e).笔者所在课题组编码设计了两种多组分核酸酶，通过一步退火反应构建了一种四面体结构的多色框架核酸.结构中两种核酸酶能够有效地识别特定的miRNA靶标，并在镁离子的作用下进行结构断裂和靶标的循环利用，实现了体系中荧光信号的有效扩增和检测灵敏度的提高(图2f)[60].

图2 基于框架核酸的核酸检测

2.2 活细胞离子检测

金属离子在细胞信号转导和酶催化等生物过程中起着重要作用[61-62].例如，在肿瘤细胞周围，氢离子(H+)和钾离子(K+)通常具有相较于正常细胞更高的浓度，由此抑制T细胞的功能和活性，使肿瘤细胞躲过免疫系统的清除[63-65].Peng等[66]设计了两种框架核酸制成的纳米支架，纳米支架底部偶联胆固醇分子，通过疏水作用将结构锚定在细胞表面的磷脂双分子层上(图3a).两个纳米支架顶端分别偶联可对H+响应的分裂性核酸适体和荧光分子，当体系中存在H+时，两个纳米支架的分裂性核酸适体共同结合H+，其顶端的荧光分子相互靠近发生荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)效应，指示细胞膜表面H+的存在.进一步将分裂性核酸适体用K+的核酸适体进行封锁，仅在细胞表面同时存在H+和K+时发生信号响应，从而实现了细胞表面H+和K+的同时成像.

图3 基于框架核酸的活细胞离子检测

2.3 活细胞中其他生物分子检测

除核酸和离子外，细胞中还存在着许多生物分子(如蛋白、ATP、外泌体等)，它们对细胞的生理功能起着重要的调节作用.例如，端粒酶通常在癌细胞中过量表达，可促进癌细胞的无限分裂和肿瘤组织的生长[78-79]；细胞环境ATP浓度异常已被证明与许多疾病，如低血糖、贫血、帕金森病和一些恶性肿瘤密切相关[80-82]；外泌体作为一种纳米胶囊泡，在细胞间通讯，包括在肿瘤的产生与转移中发挥着重要的作用[83-84].框架核酸具有高度的可编程性，因此，可以对框架核酸结构进行多功能化，而偶联可以识别生物分子的单元，即可实现细胞中多种生物分子的检测.

细胞表面的多聚糖在癌症和肿瘤的免疫监控等过程中具有重要作用[85].Peri-Naor等[86]在DNA“三臂结”结构顶端修饰了特异及非特异靶向活细胞表面糖蛋白的结构和荧光分子，通过荧光输出实现了细胞表面蛋白的糖基化水平检测(图4a).Feng等[87]将四面体框架核酸的底部修饰三个荧光分子，顶端序列延伸为组装有纳米金颗粒的端粒酶引物，当细胞中存在端粒酶时，顶端的端粒酶引物序列可进行延伸，使纳米金与荧光分子之间的距离增加，从而实现细胞内端粒酶活性的原位成像(图4b).Zhao等[88]在四面体结构探针的一个端部设计了能够靶向外泌体的结构探针，通过与外泌体结合造成的探针结构解离恢复荧光信号响应，从而实现了细胞膜表面外泌体的实时检测(图4c).

此外，通过在框架核酸结构中集成多功能响应元件，可以利用框架核酸动态结构的变化实现细胞内特定位置生物分子的检测.例如，Du等[89]将能够识别H+的i-motif单元与ATP核酸适体单元集成在三棱柱结构的框架核酸中，实现了溶酶体中ATP分子的原位检测与成像(图4d).溶酶体内部呈酸性，因此，当探针进入溶酶体后，H+会使i-motif单元折叠成特定的四链体结构，释放出的核酸适体能够特异结合溶酶体中的ATP，并折叠成一定的空间结构，使序列上标记的荧光探针相互靠近发生FRET信号响应.

图4 基于框架核酸的生物分子检测

2.4 循环肿瘤细胞检测

近年来，循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells, CTCs)在癌症诊断、治疗和监控等方面的临床表现逐渐崭露头角，被认为是检测转移、治疗癌症和疾病预后的重要生物标志物[90-91].发展能在血液中高效灵敏检测和分离富集CTCs的方法，并在此过程中保持细胞的活性，对于癌症的早期诊断、个体化治疗和病理学研究具有十分重要的意义.目前，应用于临床的CTCs检测和分离方法主要基于免疫荧光技术或PCR核酸检测[91-92],如唯一通过美国FDA和我国SFDA正式批准的检测CTCs的CellSearch系统是基于免疫磁珠分离方法对CTCs表面过表达的上皮细胞黏附分子(EpCAM)进行识别，来检测分离CTCs[93].然而，目前这类技术仍存在操作步骤繁琐、检测时间长、成本昂贵、灵敏度及特异性不佳等缺点，并且在检测分离的同时会对细胞活性产生破坏.框架核酸具有优良的生物相容性、结构有序性、多功能化能力以及纳米级定位能力，因此，可设计多样化的功能性结构偶联生物功能分子，以实现CTCs的无损和高灵敏检测[94].

Li等[95]设计了一种四面体DNA框架核酸用于血液中CTCs的高亲和力捕获(图5a).框架核酸结构的一个顶点修饰生物素用来与磁珠相连，其余三个顶点延伸出核酸适体结构，用于CTCs表面EpCAM蛋白的特异性结合.在空间结构上，框架核酸形成的拓扑结构连接了多价核酸适体，相比于核酸适体单一结构，与细胞膜表面蛋白的结合能力更强，亲和力可提高约19倍，因此显著提高了CTCs的捕获和检测效率.由于细胞表面蛋白的分布具有一定的异质性和流动性，为了减少单一目标蛋白捕获可能会引起的假阴性结果，Qin等[96]进一步将框架核酸的三个顶点分别延伸出三种不同的核酸适体结构，分别靶向CTCs表面的EpCAM、HER2和EGFR三种蛋白，达到了精确捕获不同种类CTCs的目的(图5b).由于核酸结构可以在一定条件下发生杂交和解离，因此，通过框架核酸捕获的活细胞可以进一步用于人工再培养和病理研究.

生物分子在界面上的构型和密度会影响界面反应效率，因此，除了将框架核酸直接作为捕获探针用于细胞捕获，一些基于界面捕获的策略也通过框架核酸的空间拓扑结构来调节捕获探针在空间的分布，提高界面捕获效率[97-99].例如，Zhou等[100]利用四面体框架核酸调节EpCAM核酸适体在金电极表面的分布，有效提高了CTCs的捕获效率，并结合杂交链式反应实现了电化学检测信号的扩增(图5c).Peng等[101]同样利用四面体框架核酸的空间调控性能实现了丝网印刷电极表面CTCs捕获和检测效率的提高.Zhang等[102]在微流控芯片中修饰了四面体框架核酸结构探针，通过其界面调控性能将CTCs的捕获效率提高近60%，细胞存活率高达91%，并通过酶切作用实现了活细胞的无损释放，为有序界面的微流控芯片设计提供了新思路(图5d).

图5 基于框架核酸的CTCs捕获检测

3 结论及展望

框架核酸作为近年来发展的一种新型纳米材料，具有精准可调的空间拓扑结构，在活细胞诊断和检测中崭露头角.框架核酸结构具有一定的刚性和空间尺寸，因此，可以在界面组装中起到调控生物探针间距和密度的作用，以提高生物探针捕获活细胞的反应活性.另外，框架核酸一般作为探针载体用于活细胞诊断和检测中，具有以下明显优势：①框架核酸由天然核酸组成，具有良好的生物相容性和极低的细胞毒性；②框架核酸高度的结构可控性和尺寸均一性，可有效提高检测分析的重现性；③框架核酸可以在无转染试剂辅助的情况下直接穿过细胞膜，并有效保护所载带的生物分子长时间抵御生理环境中核酸酶的降解，是细胞分子诊断和分析的理想载体.由于框架核酸易修饰和易功能化的性质，在其结构中偶联具有特定功能的生物分子，可以构建多种具有特定功能的分子机器和反应探针，在活细胞分子诊断中具有广阔的应用前景.由于单细胞中生物标志物的含量、分布空间和具体位置对于研究细胞信号转导和疾病的发生、发展过程至关重要，因此，仍有待开发具有更精细功能及智能响应型的框架核酸分子探针，对活细胞相关的生物分子成像进行更深入的研究，并将其真正应用于临床医学中.