Salubrinal通过eIF2α信号通路治疗非酒精性脂肪肝

张诗琪，刘大全，2，李心乐，2，张平，2，3△

非酒精性脂肪肝病（NAFLD）是一种肝内脂质代谢异常综合征，其诱因可能与肥胖、高脂饮食引起的过量脂质摄入有关［1］。肝细胞发生脂肪变性是NAFLD的早期病理改变之一；且肝细胞内脂质沉积的增加也是疾病进展的重要标志［2］。内质网（ER）是细胞内脂质合成的重要部位。研究表明，ER应激在脂质代谢调节中起到至关重要的作用，并可以影响肝细胞内脂质积累［3-4］。虽然证据表明ER应激参与调控脂肪肝的发生进展，但对于ER应激在肥胖引起的NAFLD 中的作用还需进一步探讨。Salubrinal 是一种真核翻译起始因子2α（eIF2α）去磷酸化的选择性抑制剂，可以保护细胞免受ER应激诱导的凋亡损伤［5］。本课题组前期实验证实，Salubrinal 可以通过维持eIF2α磷酸化促进骨创伤的愈合［6］，调节骨髓间充质干细胞成骨分化进而改善骨丢失［7］，并在改善骨质疏松和缺血性骨坏死方面也有显著效果［8-9］。尽管研究证实Salubrinal通过调控eIF2α相关信号通路可以缓解许多疾病，但其在肥胖和脂质代谢中的作用尚不清楚。因此，本课题组提出ER应激在肥胖诱导的NAFLD 中发挥关键作用，而Salubrinal 可通过eIF2α 信号通路抑制ER 应激从而调控脂质代谢的假说。为验证此假说，本研究通过建立NAFLD模型，评估Salubrinal 对肥胖和肝脂肪变性的影响，探讨ER 应激调控脂质沉积的关键作用及潜在病理机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 30 只SPF 级雌性C57BL/6 小鼠，14 周龄，体质量约为18 g，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，动物合格证号为SYXK（津）：2016-0012；动物饲料购于北京华阜康生物有限公司。实验过程中动物自由摄水、食；保持室温环境约25 ℃，12 h/12 h 明暗循环照明条件。实验动物饲养和管理遵循天津医科大学动物管理规定进行，本研究由天津医科大学伦理委员会批准。

1.1.2 实验试剂 Salubrinal 购于Tocris Bioscience 公司；血糖、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）比色试剂盒购于Cardio Chek 公司。主要抗体：热休克蛋白70 蛋白5（Bip）兔源抗体购于美国Invitrogen公司（二抗为山羊抗兔，抗体批号为PA1-014A）；真核启动因子2α（eIF2α）、真核启动因子2α 磷酸化（p-eIF2α）、转录激活因子4（ATF4）、内参β-actin兔源抗体购于Cell Signaling 公司（二抗均为山羊抗兔，抗体批号分别为#9722、#9721、#11815和#8480）；CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）兔源抗体购于武汉三鹰生物技术有限公司（二抗为山羊抗兔，抗体批号为15204-1-AP）；其他试剂购于Sigma公司。

1.1.3 实验仪器 动物体成分分析仪购于Impedi Vet 公司；RM2255石蜡切片机及冰冻切片机购于Leica公司；CKX41SF倒置相差显微镜及BX41-12H02 普通正置显微镜购于Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 适应性喂养1周后，采用随机数字表法将30只动物分为对照（SCD）组、高脂饮食（HF）组和高脂饮食+Salubrinal 治疗（HF+S）组，每组10 只。除SCD 组给予标准食物喂养外，其余2组给予含脂量为60%的高脂饮食喂养。

1.2.2 给药方法 将10 mg Salubrinal溶于50 mL丙二醇溶剂中，涡旋震荡充分混匀溶解后完成治疗药物制备；对照试剂为丙二醇［9］。4周高脂肪喂养后，HF+S组接受Salubrinal皮下注射治疗，Salubrinal 注射剂量1 mg/kg，每日固定时间注射1次，治疗时间为4周；同时给予SCD组和HF组注射等量的对照试剂［7］。

1.2.3 体成分和生化分析 摄食量每3 d测定1次，动物体质量、体成分每周测定1 次，小鼠体质量指数（BMI）采取g/cm2计算，身体长度以小鼠鼻子到尾部的标准进行测量［10］。所有数据均由本实验外专业人员测定并记录。动物处死前禁食12 h，取眼眶血进行空腹血糖、TC、TG测定。

1.2.4 组织取材 治疗4周后处死动物，分离并收集小鼠皮下、子宫周、肾周脂肪及肝脏样本进行湿质量测定并记录。留取部分小鼠肝脏组织固定于4%多聚甲醛中，用于下一步组织学分析。

1.2.5 组织学分析 小鼠肝脏组织样本固定在4%多聚甲醛48 h 后进行下一步脱水处理。部分样本组织经乙醇梯度脱水后包埋于石蜡中，切片厚度为5 μm，连续切片后通过HE染色观察肝脏病理形态变化。另一部分样本组织经蔗糖梯度脱水后用于冰冻切片，切片厚度为8 μm，连续切片后通过油红O 染色观察肝脏脂质沉积情况。每组样本选取同一位置的石蜡或冰冻切片，并在光镜下观察、测量统计。

1.2.6 Western blot 分析 称取肝组织样本50 mg，使用高压灭菌过的组织剪剪碎并置于研磨管中处理，加入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA 裂解缓冲液500 μL，冰上裂解20 min 后，4 ℃下14 000 r/min 离心15 min，提取上清液并测定蛋白浓度。采用SDS-PAGE，上样细胞总蛋白浓度为30 μg，转膜，5%脱脂奶粉封闭，4 ℃下过夜孵育一抗，TBST清洗3 次，室温孵育二抗2 h，ECL 化学发光后曝光检测。测量软件采用Image J 分别测定目的蛋白和β-actin 灰度值，目的蛋白/β-actin代表蛋白相对表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0 统计软件进行数据分析，所有计量数据用均数±标准差（±s）表示，组间均数比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间多重比较采用LSD-t法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Salubrinal减轻高脂饮食引起的体质量增加 见表1。与SCD 组相比，HF 组与HF+S 组体质量明显增加（均P＜0.05），第2 周、第4 周HF 组与HF+S 组间体质量差异无统计学意义。Salubrinal治疗2周后（第6 周），HF+S 组小鼠体质量较HF 组减轻（P＜0.05），并在4周的治疗时间内逐渐稳定。此外，3组间平均每日摄食量差异无统计学意义。

2.2 Salubrinal缓解高脂饮食诱导的肥胖 治疗第4周体成分分析表明，与SCD 组相比，HF 组小鼠BMI升高，而HF+S 组较HF 组BMI 降低（均P＜0.05），并恢复到SCD组水平。同时，HF组较SCD组全身体脂率明显增加，Salubrinal 降低HF+S 组小鼠全身体脂率，但体脂率水平仍高于SCD 组（均P＜0.05），见表2。此外，实验结束前观察动物体型可见，与SCD 组相比，HF组小鼠肥胖体型更明显，治疗后HF+S组与HF组相比体型较小，见图1。

Tab.1 Changes of body mass and average daily food intake throughout the experiment between three groups of C57BL/6 mice表1 实验过程中3组小鼠的体质量变化和每日平均摄食量比较（n=10，g，±s）

Tab.1 Changes of body mass and average daily food intake throughout the experiment between three groups of C57BL/6 mice表1 实验过程中3组小鼠的体质量变化和每日平均摄食量比较（n=10，g，±s）

＊＊P＜0.01；a与SCD组比较，b与HF组比较，P＜0.05；表2～6同

组别SCD组HF组HF+S组F第2周体质量19.75±0.36 22.55±1.05a 22.62±0.95a 37.554＊＊第4周体质量21.44±1.47 25.43±1.11a 25.00±1.51a 25.310＊＊第6周体质量22.24±1.25 27.94±1.76a 26.05±2.17ab 27.093＊＊第8周体质量23.58±1.74 31.79±1.87a 27.22±1.99ab 48.414＊＊平均每日摄食量2.16±0.08 2.16±0.16 2.21±0.06 1.148

Tab.2 Comparison of body composition(BMI and body fat)between three groups of C57BL/6 mice表2 3组小鼠体成分（BMI和全身体脂率）比较（n=10，±s）

Tab.2 Comparison of body composition(BMI and body fat)between three groups of C57BL/6 mice表2 3组小鼠体成分（BMI和全身体脂率）比较（n=10，±s）

组别SCD组HF组HF+S组F BMI（g/cm2，×10-2）33.91±2.14 45.21±2.45a 35.60±2.58b 64.477＊＊全身体脂率（%）35.82±2.71 48.26±3.56a 40.78±4.28ab 30.650＊＊

Fig.1 The body sizes of C57BL/6 mice at the end of experiment图1 C57BL/6小鼠实验结束前体型

2.3 Salubrinal 对肥胖小鼠的血脂、空腹血糖的影响 与SCD 组相比，HF 组TG、TC、空腹血糖明显升高（均P＜0.05）。Salubrinal 治疗后HF+S 组较HF 组TG、TC、空腹血糖水平降低（均P＜0.05），但TC、空腹血糖水平仍高于SCD组（P＜0.05），见表3。

Tab.3 Comparison of serum TG,TC and fasting blood glucose between three groups of C57BL/6 mice表3 3组小鼠TG、TC和空腹血糖比较（n=10，mmol/L，±s）

Tab.3 Comparison of serum TG,TC and fasting blood glucose between three groups of C57BL/6 mice表3 3组小鼠TG、TC和空腹血糖比较（n=10，mmol/L，±s）

组别SCD组HF组HF+S组F TG 0.62±0.03 0.97±0.17a 0.74±0.14b 19.502＊＊TC 2.57±0.21 4.49±0.54a 3.41±0.41ab 54.784＊＊空腹血糖4.44±0.425 8.68±2.44a 5.39±0.89ab 21.377＊＊

2.4 Salubrinal 减轻脂肪堆积 与SCD 组相比，HF组内脏及皮下脂肪堆积明显，其中子宫周、肾周、皮下脂肪湿质量明显增加（均P＜0.05）。Salubrinal 治疗后，与HF组相比，HF+S组各部位脂肪湿质量明显降低，脂肪堆积情况减轻，但仍高于SCD 组（均P＜0.05），见表4。

Tab.4 Comparison of mass of utenes,kidney and subcutaneals of fat between three groups of C57BL/6 mice表4 3组小鼠子宫周、肾周、皮下脂肪质量比较（n=10，g，±s）

Tab.4 Comparison of mass of utenes,kidney and subcutaneals of fat between three groups of C57BL/6 mice表4 3组小鼠子宫周、肾周、皮下脂肪质量比较（n=10，g，±s）

组别SCD组HF组HF+S组F子宫周脂肪0.19±0.06 0.72±0.24a 0.39±0.14ab 26.708＊＊肾周脂肪0.14±0.08 0.62±0.18a 0.30±0.15ab 29.825＊＊皮下脂肪0.17±0.09 0.98±0.46a 0.52±0.26ab 17.384＊＊

2.5 Salubrinal 对肥胖小鼠肝脏的保护作用 各组肝脏大体标本对比可见，与SCD 组相比，HF 组小鼠肝脏肿大，色泽为淡黄，切面结构模糊，有油腻感；而HF+S组小鼠肝脏较HF组形态较小，色泽红润光泽，见图2、表5。HE 染色结果见图3，与SCD 组肝组织切片镜下视野相比，HF 组肝小叶形态欠规则，胞浆中出现大小不一融合性空泡（箭头所示），形似脂肪细胞，肝细胞气球样变明显，细胞核偏移，细胞排列紊乱；Salubrinal 治疗后，HF+S 组肝小叶结构较HF组规则，胞浆内无明显脂质小滴，细胞核圆排列整齐。油红O染色结果见图4，相比于SCD组，HF组镜下视野中出现明显脂滴着染颗粒，呈红色（箭头所示），而HF+S 组较HF 组脂滴数目明显减少。此外，SCD组肝组织内无明显脂滴形成，HF组脂滴数目与SCD组相比明显增多（P＜0.05），而Salubrinal治疗后HF+S 组较HF 组脂滴数目显著减少（P＜0.05），见表5。

Fig.2 General observation of liver tissues in three groups of mice图2 3组小鼠肝脏肉眼下观察

Tab.5 Comparison of liver weight and the number of lipid droplets between three groups of C57BL/6 mice表5 3组小鼠肝脏质量和肝脏脂滴数目比较 （±s）

Tab.5 Comparison of liver weight and the number of lipid droplets between three groups of C57BL/6 mice表5 3组小鼠肝脏质量和肝脏脂滴数目比较 （±s）

组别SCD组HF组HF+S组F肝脏质量（n=10，g）1.78±0.14 2.44±0.41a 2.07±0.23ab 13.597＊＊肝脏脂滴数目（n=7，个/视野）0 110.29±31.68a 11.71±6.73b 73.448＊＊

Fig.3 Changes of pathology of liver under light microscope in three groups(HE staining,×200)图3 3组小鼠肝脏病理改变光镜下观察（HE染色，×200）

Fig.4 Changes of liver lipid droplet deposition under light microscope in three groups(Oil red O staining,×200)图4 3组小鼠肝脏脂质小滴光镜下观察（油红O染色，×200）

2.6 Salubrinal 对肝组织中eIF2α 信号通路相关蛋白表达的影响 肝组织蛋白印迹检测分析表明，与SCD 组相比，HF 组p-eIF2α/eIF2α 表达量无显著变化，Bip、ATF4和CHOP的表达水平显著升高（均P＜0.05）。与HF 组相比，Salubrinal 治疗后增加了peIF2α/eIF2α 表达量，并进一步增强Bip、ATF4 的表达水平（均P＜0.05），但是显著降低了CHOP表达量（P＜0.05）；与SCD 组比较，HF+S 组CHOP 表达水平差异无统计学意义，见图5、表6。

Fig.5 The marker proteins of eIF2α signaling pathway detected by Western blot assay in three groups图5 Western blot检测3组eIF2α信号通路相关蛋白的表达

Tab.6 Effects of salubrinal on eIF2α signaling pathway related proteins that expressed in the liver tissues表6 Salubrinal对3组肝样本eIF2α信号通路相关蛋白表达的影响（n=3，±s）

Tab.6 Effects of salubrinal on eIF2α signaling pathway related proteins that expressed in the liver tissues表6 Salubrinal对3组肝样本eIF2α信号通路相关蛋白表达的影响（n=3，±s）

组别SCD组HF组HF+S组F Bip 0.42±0.03 0.68±0.08a 0.81±0.04ab 37.948＊＊p-eIF2α/eIF2α 0.74±0.10 0.61±0.15 1.26±0.18b 16.412＊＊ATF4 0.22±0.05 0.47±0.11a 0.89±0.14ab 30.186＊＊CHOP 0.20±0.11 0.93±0.15a 0.40±0.11b 27.002＊＊

3 讨论

3.1 Salubrinal 可以有效缓解由高脂饮食诱导的肥胖 高热量摄入导致的肥胖症是目前世界范围内主要公共卫生问题之一，是导致慢性疾病如心血管疾病、NAFLD、2 型糖尿病和某些癌症的主要因素［11］。在人群大样本队列分析中，BMI 和机体总肥胖与相关代谢性疾病的风险呈正相关。本研究结果表明，通过高脂饮食诱导的动物肥胖模型与正常饮食组相比，高脂组的体质量明显升高，且通过体脂率、BMI分析与动物体型观察可见，高脂组小鼠的肥胖表型更为明显。经过4 周Salubrinal 治疗后，治疗组小鼠肥胖体型较高脂组缓解，BMI 和体成分分析表明小鼠的平均体脂率更接近正常饮食小鼠。

与全身总脂肪量相比，体内脂肪分布和脂肪组织功能受损能更好地预测胰岛素抵抗和相关并发症。同时，据相关报道，脂肪组织功能障碍主要是由受损的脂肪组织扩张、脂肪细胞肥大以及脂质代谢改变共同导致［12］。在本研究中，与正常组相比，高脂组小鼠体内各部位脂肪堆积均有所增加；相关血脂检测也显示，高脂组的TG、TC和空腹血糖指标均高于正常组小鼠。Salubrinal 明显降低了小鼠皮下和脏器脂肪含量，同时血脂、空腹血糖水平也明显降低。结果表明，高脂饮食会引起肥胖的发生，导致全身各部位脂肪积累增加，并造成机体血脂异常和胰岛素抵抗的发生。Salubrinal 可通过减少全身和各部位脂肪堆积、调控脂质代谢，从而延缓高脂饮食诱导的肥胖症发展。

3.2 Salubrinal 可减轻肥胖诱导的肝脂肪变性 能量摄入和能量消耗之间发生不平衡时，或者当脂肪组织中的脂质蓄积过多时，则导致机体肥胖；而当脂质出现在非脂肪组织器官（例如肝脏或大网膜）时，则发生“异位脂肪蓄积”［13］。NAFLD 开始的标志即为肝脏内脂质沉积引起的肝脂肪变性，并且明显的肝脂肪沉积是疾病进展的危险因素［2］。研究表明，ER 应激引起的高胆固醇血症会引起肝脏脂质沉积和肝脂肪变性［14］。虽然肝脂肪变性通常被认为是良性病变，但随着脂质代谢的进一步紊乱，肝炎、肝硬化和肝癌的罹患风险会增加［15］。在本研究中，与正常组相比，肉眼观察下高脂饮食组小鼠的肝脏组织发生明显的肿大和脂肪变，且在光镜下也发现肝组织中脂质沉积明显，进一步证实了脂质代谢紊乱对肝脏的影响。Salubrinal 缓解了肝脂肪变性，通过降低肝脏内脂质沉积，抑制了NAFLD发展的进程。

3.3 Salubrinal 可 通 过eIF2α信号通路缓解NAFLD 目前，对于NAFLD的致病机制存在多种观点，潜在致病机制可能与ER应激、氧化应激、胰岛素抵抗有关［1］。多项研究表明，ER应激参与NAFLD中脂质沉积过程，近期有报道证实eIF2α 信号通路参与调控脂肪生成［16-17］。ER 应激不仅是肥胖及其相关代谢性疾病的致病因素，同时肥胖和肝脂肪变性的发展也会导致内质网稳态的进一步失衡，从而形成恶性循环，加剧疾病的进展。ER是真核生物细胞内蛋白质和脂质合成的主要场所，肝脏作为脂质代谢的重要器官，在“异位脂肪蓄积”发生时，ER 应激会通过介导非折叠蛋白反应调控脂质代谢［18］。在本研究中，高脂饮食组小鼠肝组织中Bip、ATF4表达水平的升高以及肝脂肪变性表明ER 应激的发生；Salubrinal 治疗后肝组织内脂质沉积减少且伴随着p-eIF2α/eIF2α 表达量的增加，表明Salubrinal 可通过调控ER应激降低脂质沉积和肝脂肪变性。同时，CHOP 作为eIF2α 信号通路与凋亡的连接体也参与调控脂质代谢［17］。据报道，抑制eIF2α/CHOP信号通路中CHOP 的表达量可以缓解胰岛素抵抗的发生［19］。与此结论相一致，本研究表明，肥胖诱导的肝脂肪变性发生时，CHOP 表达量显著上升，而Salubrinal 治疗后，通过eIF2α 信号通路抑制CHOP的表达从而减少脂质沉积，调控脂质代谢。

综上所述，本研究证明了eIF2α 在肥胖诱导的NAFLD中的关键作用，Salubrinal可缓解肥胖造成的脂肪蓄积和血脂、血糖紊乱，并通过减少肝组织中脂肪沉积抑制肝脂肪变性的进一步发展。此外，本研究证实了Salubrinal 治疗NAFLD 的相关机制，即Salubrinal 可通过eIF2α 信号通路调控ER 应激从而缓解肝脂肪变性，并抑制脂质沉积。