EBF1-shRNA对肺腺癌细胞体内外生物学特性的影响

王琳，李丁，秦婷婷，任丽

近年来，肺癌发病率逐年上升，5年生存率仅为15%［1］；其中约85%是非小细胞肺癌（NSCLC），而肺腺癌是女性和非吸烟者NSCLC的常见类型［2］。肺腺癌的控制已成为全世界广泛关注的问题，研究肺腺癌细胞的增殖及转移对改善肺腺癌患者预后具有积极意义，但至今仍缺乏针对肺腺癌细胞增殖及转移更有效的治疗方法［3-4］。已有研究证实，肿瘤的形成往往是由基因突变引起，包括癌基因的激活和肿瘤抑制基因的失活或缺失［5］。研究显示，肺腺癌通常缺失INK4a/ARF 位点，其编码2 种抑制蛋白p16INK4a和p14ARF，是细胞周期蛋白依赖激酶（cyclin dependent kinase，CDK）抑制剂，能够调节细胞周期［6］。另有研究发现，儿童急性淋巴细胞白血病中早期B 细胞因子1（EBF1）表达缺失或功能缺陷与肿瘤细胞增殖相关［7-8］。本研究通过抑制肺腺癌细胞中高表达EBF1基因，对可能影响肺腺癌细胞增殖、侵袭及迁移能力的作用机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要试剂仪器 SPF级雌性Balb/c Nu/Nu裸鼠8 只，体质量18～20 g，6～8 周龄，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，实验动物使用许可证：SCXK（京）2016-0002。饲养于独立通风笼中，恒温恒湿，喂饲灭菌裸鼠饲料，饮用双蒸水。肺癌组织及癌旁组织芯片（上海芯超公司）。Laemmli Sample Buffer（美国BIO-RAD 公司）；EBF1一抗（羊抗鼠及兔抗人，美国Sigma公司）；CDK6一抗（兔抗人）、P21一抗（兔抗人）、P27 一抗（兔抗人）购自美国Santa Cruz Biotechnology 公司；GAPDH 一抗（鼠抗人）、β-actin 一抗（鼠抗人）购自美国BD Biosciences 公司；Western blot二抗（北京碧云天公司）；酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒，BrdU试剂盒（美国Roche公司）。pSUPE-Pretro-Nea-EBF1 及自由序列购自Sigma，逆转录及PCR 试剂盒购自Thermo。超微量分光光度计Nanodrop2000（美国Thermo 公司）；酶标仪BioTel Synergy H2（美国BioTek公司）；流式细胞仪（美国BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化染色检测EBF1 在肺癌及癌旁组织中的表达 组织芯片室温梯度乙醇脱蜡、水化，柠檬酸钠热抗原修复后滴加3%过氧化氢灭活内源酶活性，10%山羊血清封闭30 min，滴加一抗，4 ℃过夜，滴加二抗，显色，苏木素复染，1%盐酸乙醇分化，0.5%氨水反蓝后梯度乙醇脱水，凉干后滴加中性树胶封片。以出现明显棕色或黄色颗粒为阳性。

1.2.2 细胞培养和转染 肺腺癌细胞系：A549、H441；小细胞肺癌细胞系：H209、H1155；正常对照细胞系：正常支气管上皮细胞系HBE及正常肺上皮细胞系Beas-2B，上述细胞均购自ATCC。用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养。用磷酸钙转染法将细胞转染pSUPE-Rretro-Neo-EBF1 和自由序列分别作为实验组（shRNA-EBF1组）及对照组（shRNA-control组）。

1.2.3 PCR 检测EBF1在各细胞系中的表达 提取细胞RNA，逆转录获得cDNA单链。以cDNA为模板，GAPDH作为内参基因，PCR检测EBF1的表达。引物序列：EBF1上游5'-AAAGCATCCAACGGAGTGGA -3'，下游 5' -TTCCA ATCTGCGGAAATTCCA-3'，扩增片段长度562 bp。PCR扩增条件：50 ℃2 min；95 ℃2 min；95 ℃15 s，60 ℃15 s，72 ℃1 min，36个循环，扩增产物在含0.5%溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶电泳中分离。

1.2.4 Western blot 检测A549 细胞EBF1、CDK6、P21、P27 表达 将转染48 h的A549细胞用预冷的含有5%β-巯基乙醇的蛋白提取缓冲液滴加到细胞培养皿中提取细胞总蛋白，超微量分光光度计测定蛋白浓度，取50 μg蛋白在SDS-PAGE进行电泳分离后转膜到PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭，TBST洗涤，滴加一抗羊抗鼠及人EBF1（1∶200）、兔抗人CDK6（1∶200）、兔抗人P21（1∶500）、兔抗人P27（1∶500），4 ℃孵育过夜，TBST洗涤，二抗兔抗羊（1∶2 000）、羊抗兔（1∶1 000）孵育后，ECL化学发光和曝光显影，Image J软件分析灰度值，计算目的蛋白相对表达量。EBF1表达水平以GAPDH为内参，CDK6、P21、P27表达水平以β-actin为内参。

1.2.5 MTT法检测A549细胞及H441细胞增殖能力 收集对数生长期细胞，调整细胞悬液浓度至1×103个/孔，接种于96孔板中，培养基总量为200 μL，每组细胞设15个复孔。待细胞贴壁每组取3孔细胞，加入10 μL MTT溶液，37 ℃孵育4 h后终止实验，利用酶标仪检测各孔490 nm处的光密度（OD）值。每24 h检测1次，连续测5 d，绘制生长曲线，以对照组生长曲线作为参考，比较实验组细胞生长情况。

1.2.6 BrdU 实验检测A549 及H441 细胞增殖能力 收集对数生长期细胞，调整细胞悬液浓度至1×103个/孔，接种于96孔板中，每孔含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基100 μL，5%CO2，37 ℃孵育过夜，每组设3个复孔，加入10 μmol BrdU（10 μL/孔），37 ℃孵育过夜，轻拍96孔板弃去上清，使用Cell Proliferation ELISA，BrdU 试剂盒加入FixDenat（bottle2）200 μL/孔，室温孵育30 min，轻拍96孔板弃去上清，加入100 μL/孔BrdU 抗体室温孵育90 min，轻拍96 孔板弃去上清，加入200 μL/孔洗液，轻拍96 孔板弃去上清，加入100 μL/孔显色底物，30 min 内酶标仪在450 nm及690 nm处测量各孔的OD值，去除本底，计算ΔOD=OD450-OD690，以此代表细胞增殖过程中BrdU掺入量，即表明细胞增殖能力。

1.2.7 细胞划痕实验检测A549 细胞迁移能力 将转染shRNA-EBF1 及shRNA-control 的A549 细胞分别接种于6 孔板，待细胞约70%融合时，用200 μL加样枪枪头在培养皿上划痕，PBS冲洗3遍，分别于划痕时及培养24 h时对划痕线拍照，计算细胞迁移率。细胞迁移率=（0 h 边缘距离-24 h 时边缘距离）/0 h边缘距离×100%。

1.2.8 Transwell 实验检测细胞侵袭能力 将Matrigel 胶用RPMI 1640 培养基以1∶20 稀释，在Transwell 小室中加入100 μL，37 ℃孵育4 h。用不含血清的RPMI 1640 培养基调整A549细胞浓度为5×104/mL，取200 μL细胞铺于上室，下室中加入500 μL含10%血清的RPMI 1640培养基。37 ℃培养24 h后，取出小室，PBS冲洗3遍，加入4%多聚甲醛室温固定30 min，加入0.5%结晶紫染色10 min，PBS 冲洗，棉签轻轻擦去表面细胞。随机拍照5个视野，并计算穿膜细胞数。

1.2.9 体内成瘤实验 8 只裸鼠按照随机数字表法分为2组，每组各4 只，分别皮下注射A549-shRNA-EBF1 及A549-shRNA-control。将2组细胞分别胰酶消化制成单细胞悬液，用PBS调整细胞浓度为5×107/mL。按无菌操作要求，每只裸鼠单侧腋窝皮下注射细胞悬液200 μL（1×107个细胞），4周后取出皮下肿瘤，拍照并称质量，同时采用Western blot 和免疫组化染色检测瘤体内EBF1的表达。

1.2.10 细胞周期测定 取对数生长期的细胞1×106个，用预冷75%乙醇于4 ℃固定过夜，1 500 r/min离心5 min，弃上清，以3 mL的PBS洗涤3次，加入400 μL溴化乙锭（PI，50 mg/L），100 μL RNase A（100 mg/L），4 ℃避光孵育30 min，流式细胞仪上机检测，计算各种细胞中G0/G1期、S期及G2期细胞所占比例。

1.3 统计学方法 采用GraphPad Prism 6.0软件进行数据处理。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，2组间比较用2独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EBF1在肺癌组织中的表达情况 EBF1在癌旁正常肺组织及肺癌组织的基质细胞中不表达，但在非小细胞肺癌及小细胞肺癌细胞中表达，并且EBF1主要表达于肺癌细胞的细胞核中，见图1。

2.2EBF1在肺癌细胞系中的表达情况 非小细胞肺癌细胞系A549 和H441 及小细胞肺癌细胞系H209 和H1155 中均检测到EBF1基因表达，正常支气管上皮细胞系HBE及正常肺上皮细胞系Beas-2B内未见EBF1表达，见图2。

2.3 转染EBF1特异性shRNA抑制肺腺癌细胞在体内外的增殖 Western blot 结果显示，shRNA-EBF1组较shRNA-control 组EBF1 蛋白表达量降低，见图3、表1。BrdU 实验显示shRNA-EBF1 处理后A549及H441细胞的增殖水平较shRNA-control明显降低（P＜0.05），见表1。MTT实验结果发现，培养第3天开始，转染shRNA-EBF1 的A549 和H441 细胞增殖能力明显减弱，见图4。小鼠体内成瘤实验发现，与shRNA-control 组相比，shRNA-EBF1组细胞形成的肿瘤平均质量明显降低，见表1、图5；且shRNAEBF1组肿瘤内EBF1表达明显下降，见图6。

2.4 转染EBF1特异性shRNA抑制肺腺癌细胞的侵袭及迁移 划痕实验发现，shRNA-EBF1 组细胞铺片24 h 后迁移能力较shRNA-control 组细胞缓慢（P＜0.01），见图7、表2。侵袭实验发现，shRNAEBF1组细胞侵袭能力较shRNA-control 组明显下降（P＜0.01），见图8、表2。

Fig.1 The expression of EBF1 in lung cancer and peripheral lung tissues（Immunohistochemical staining，×400）图1 EBF1在癌旁组织及肺癌组织中的表达情况（免疫组化染色，×400）

Fig.2 The expression of EBF1 in lung cancer cell lines图2 EBF1在肺癌细胞系中表达情况

Fig.3 EBF1 specific shRNA down-regulated its expression in A549 cells图3 EBF1特异性shRNA下调其在A549表达情况

Tab.1 Comparison of EBF1 protein,cell proliferation level and ability of tumorigenicity between A549-shRNA-EBF1 group and shRNA-control group表1 shRNA-EBF1组和shRNA-control组细胞EBF1蛋白、细胞增殖水平及小鼠成瘤能力比较

Fig.4 Effects of EBF1 knockdown on cell growth curves图4 下调EBF1后对细胞生长曲线的影响

2.5 EBF1-shRNA阻滞A549细胞周期于G1期 与shRNA-control 组相比，shRNA-EBF1 组G0/G1 期细胞比例明显增加，而S 期细胞比例降低（P＜0.01），见表3。

2.6 EBF1-shRNA 下调A549 细胞周期调控相关蛋白CDK6的表达 与shRNA-control组相比，shRNAEBF1 组周期蛋白依赖激酶CDK6 表达下调，同时伴有P21、P27表达增高（P＜0.01），见图9、表4。

Fig.5 Effects of EBF1 knockdown on the tumorigenicity of in mice图5 下调EBF1对小鼠体内成瘤能力的影响

3 讨论

3.1EBF1基因研究现状EBF1基因位于人染色体5q34，是B细胞发育所必需的转录因子，在B细胞分化和成熟中起着重要作用［9］。研究发现，在儿童急性淋巴细胞白血病中，EBF1表达缺失，在儿童高危B 前体淋巴细胞白血病（ALL）中，EBF1缺失的频率更高［10-11］。尤其是EBF1-PDGFRB融合基因使癌细胞分化停滞在前B 细胞阶段（由于EBF1 功能缺陷）和持续增殖阶段（由于PDGFRB 激酶活性紊乱）［8］。Stone等［12］发现，EBF1和雌激素受体1（ESR1）与乳腺癌易感性增加有关。可以推测，EBF1在实体瘤的发生发展中也起着重要作用，但其作用的分子机制，特别是对肺癌的影响，目前尚不清楚。

3.2EBF1对肺腺癌A549 细胞增殖的影响及作用机制 细胞周期可分为4 个阶段：G1、S、G2 和M，它们与细胞增殖密切相关。细胞周期的异常调节对肿瘤发生机制具有重要意义。细胞周期进展受许多因素调节，如细胞周期调节蛋白、CDK、CDK 抑制剂［13］。癌基因或抑癌基因与90%以上人类肿瘤中的细胞周期变化有关。其中，与G1期相关的基因变化频率较高［14］。本研究发现，在A549 细胞中下调EBF1基因的表达能够抑制其体内外增殖，并且抑制A549细胞迁移及侵袭能力。一般而言，细胞生长抑制可能是由于细胞坏死、凋亡或者细胞周期阻滞导致。本研究发现，EBF1-shRNA 抑制A549细胞的增殖能力是通过将细胞阻滞在G1期引起的，而细胞周期与细胞增殖密切相关，表明EBF1-shRNA 通过下调EBF1在A549细胞中的表达，将A549细胞阻滞在G1期，从而抑制其在体内外的增殖能力。

Fig.6 Expressions of EBF1 in tumorigenesis of mice after EBF1 knockdown(Immunohistochemical staining，×200)图6 下调EBF1后小鼠体内成瘤中EBF1表达情况（免疫组化染色，×200）

Fig.7 Effects of EBF1 knockdown on the migration of A549 cells图7 下调EBF1对A549细胞迁移能力的影响

Fig.8 Effects of EBF1 knockdown on the invasion of A549 cells(crystal violet staining，×200)图8 下调EBF1对A549细胞侵袭能力的影响（结晶紫染色，×200）

Tab.2 Effects of down-regulating EBF1 on the migration and invasion ability of A549 cells表2 下调EBF1对A549细胞迁移及侵袭能力的影响（n=3，±s）

Tab.2 Effects of down-regulating EBF1 on the migration and invasion ability of A549 cells表2 下调EBF1对A549细胞迁移及侵袭能力的影响（n=3，±s）

＊＊P＜0.01

组别shRNA-control组shRNA-EBF1组t细胞迁移率（%）68.40±7.48 23.60±0.92 5.941＊＊穿膜细胞数（个/视野）92.33±13.30 34.67±4.33 7.140＊＊

Tab.3 Effects of down-regulating EBF1 on the cell cycle of A549 cells表3 下调EBF1对A549细胞周期的影响（n=3，±s）

Tab.3 Effects of down-regulating EBF1 on the cell cycle of A549 cells表3 下调EBF1对A549细胞周期的影响（n=3，±s）

＊＊P＜0.01

组别shRNA-control组shRNA-EBF1组t G0/G1期（%）33.58±1.41 42.06±0.99 4.914＊＊S期（%）49.49±0.83 39.23±0.79 9.005＊＊G2期（%）14.74±0.89 15.49±0.50 0.736

Fig.9 Effects of EBF1 knockdown on cell cycle regulation related proteins图9 下调EBF1对细胞周期调控相关蛋白的影响

Tab.4 The expression levels of CDK6,P21 and P27 after EBF1 knockdown in A549 cells表4 A549 细胞中下调EBF1后CDK6、P21及P27表达水平的影响

细胞周期蛋白表达丰度的改变可导致不受控制的细胞增殖甚至肿瘤［15］，其中在G1 期起作用的P21、P27蛋白最具代表性［16-17］。相关研究表明，P21及P27 蛋白表达的减少将导致细胞的异常增殖［18-19］。因此，为了进一步探讨沉默EBF1基因的表达抑制A549 细胞增殖的机制，笔者首先检测了P21、P27 蛋白的表达，发现shRNA- EBF1 组P21、P27蛋白表达上调。Kollmann 等［20］在研究淋巴瘤时发现，在p16INK4a缺失下，CDK6通过上调血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达，促进增殖和刺激血管生成并起到促进肿瘤生长的功能。因此，笔者应用Western blot技术检测了细胞中CDK6 蛋白的表达，发现shRNA- EBF1 组CDK6蛋白表达下调。当然，EBF1调控A549细胞增殖过程中是否也通过调控VEGF影响血管生成还需要以后进一步的实验加以证实。

综上所述，沉默EBF1基因的表达可将A549 细胞阻滞在G1 期而影响其增殖能力，同时伴有P21/P27表达水平的增高和CDK6蛋白表达下降，但这还需要进一步研究来证实。