依那普利对自发性高血压大鼠肾组织AngⅡ和TGF-β/Smads变化及肾纤维化的影响

陈万里，李慧慧，朱振宇，黄安安，柳占彪，齐新

高血压已成为当今社会严重损害人类健康的常见病［1］，是引发各种心脑血管疾病的重要危险因素。长期的高血压会对心脏、肾脏等靶器官造成损伤［2］。研究表明，高血压引起的肾损害已经是终末期肾病（ESRD）的第二大病因，仅次于糖尿病，且高血压会引起肾脏的纤维化［3］。肾脏纤维化是许多慢性肾脏疾病发展到ESRD 的共同途径和重要病理基础［4］。肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）是神经-体液调节机制的重要环节，其激活可引起血管收缩、水钠潴留，在高血压的发病中有重要作用，其中血管紧张素（Ang）Ⅱ是RAAS 中最重要的效应分子［5］。目前研究表明RAAS有2个主要轴：经典的血管收缩轴［肾素-血管紧张素转换酶（ACE）/AngⅡ/AngⅡ1 型受体（AT1R）轴］和血管舒张轴［ACE2/Ang（1-7）/Mas受体（MasR）轴］，它们在血管控制方面起相反作用；其中血管舒张轴对经典轴有拮抗作用，能在一定程度上延缓肾纤维化的进展［6］。目前的研究主要集中在RAAS 的血管收缩轴。AngⅡ有调节血压和促进纤维化的作用，其促纤维化作用可能与转化生长因子（TGF）-β/Smads 这一经典的信号通路有关［3］。血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）是临床上常用的以RAAS为靶点的抗高血压药物，主要通过抑制AngⅠ转化为AngⅡ进行降压。有研究发现，ACEI 类药物除可以有效降压外，还可以改善高血压引起的靶器官损害［7］。依那普利作为临床上常用的ACEI 类药物，降压效果良好，但在改善肾功能方面的研究较少。本研究主要探讨依那普利对自发性高血压大鼠（SHR）的降压效果，延缓肾纤维化作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 13周龄雄性SHR、雄性Wistar-Kyoto（WKY）大鼠，体质量（200±20）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2016-0006。所有动物均饲养于天津市人民医院动物房，适应性饲养1周后开始实验。

1.2 试剂及仪器 马来酸依那普利片（10 mg，扬子江药业集团江苏制药股份有限公司，国药准字H32026567）。血尿素氮（BUN）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。AngⅡ、血清胱抑素C（CysC）、尿微量白蛋白（mALB）试剂盒购自天津安诺瑞康生物技术有限公司。TRNzol 总RNA 提取试剂盒、FastKing cDNA 第一链合成试剂盒、SuperReal 荧光定量预混试剂（增强版）均购自北京天根生化科技有限公司。引物应用Primer Premier 5.0软件设计，由上海生工生物工程有限公司合成。电子天平购自上海天平仪器厂；大鼠尾动脉血压测定仪购自美国Kent Scientific 公司；多功能酶标仪购自美国Thermo Fisher Scientific 公司；PCR 扩增仪购自美国Bio-Rad公司；光学显微镜购自日本Olympus公司。

1.3 动物分组及给药 20只SHR 大鼠适应性喂养1周后测其尾动脉血压，编号以后按照随机数字表法分为模型组和依那普利组，每组10 只，另取10 只WKY 大鼠作为对照组。依那普利组的给药剂量为1.05 mg/（kg·d），每日1次灌胃，持续10周，模型组和对照组灌胃等量生理盐水。10周后处死动物并取材。

1.4 血压及血、尿指标检测 各组在给药前（0周）及给药后每2 周测定大鼠尾动脉血压。10 周后处死大鼠前留取尿液离心取上清，处死后取腹主动脉血静置30 min 离心取上清，采用脲酶法检测各组血清中BUN水平，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测各组AngⅡ、CysC、mALB水平。

1.5 肾组织形态结构观察 大鼠处死后切取肾组织，去包膜后多聚甲醛固定，脱水、石蜡包埋、切片。按以下步骤进行Masson染色：将切片常规脱蜡及水化，用配制好的Weigert铁苏木素染色5～10 min；用酸性乙醇分化后水洗；Masson蓝化液返蓝，水洗；蒸馏水洗1 min 后丽春红品红染色液染色5～10 min。在上述操作过程中按蒸馏水∶弱酸溶液=2∶1比例配制弱酸工作液，用弱酸工作液洗1 min，磷钼酸溶液洗1～2 min，弱酸工作液洗1 min，直接入苯胺蓝染色液中染色1～2 min；弱酸工作液洗1 min，95%乙醇快速脱水3 次，每次5～10 s；二甲苯透明3次，每次1～2 min。最后中性树胶封固，待切片干燥后，在光学显微镜下观察典型病变部位并拍照。

1.6 肾组织AngⅡ、TGF-β1及下游纤维化标志物mRNA的表达 在无RNA酶条件下提取肾组织RNA，测定浓度后用FastKing cDNA第一链合成试剂盒反转录为cDNA，用SuperReal荧光定量预混试剂盒在PCR扩增仪上进行实时荧光定量PCR，扩增条件为：95 ℃预变性15 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法分析基因相对表达水平，引物序列见表1。

1.7 统计学方法 所有数据均通过SPSS 21.0 软件进行分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组数据间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t检验，组内多个时间点间比较采用重复测量资料的方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

Tab.1 Primer sequences involved in the gene of interest表1 内参和目的基因引物序列

2 结果

2.1 依那普利对SHR大鼠的降压效果 组内比较：对照组收缩压在干预4 周时开始升高，舒张压则无明显变化（P＞0.05）；模型组收缩压在干预2 周时开始升高，舒张压则无明显变化（P＞0.05）；依那普利组收缩压和舒张压均在干预2周时开始下降。组间比较：给药前（0 周），与对照组相比，模型组和依那普利组大鼠收缩压与舒张压均显著升高（P＜0.05）；模型组与依那普利组收缩压与舒张压比较差异无统计学意义（P＞0.05）；药物干预后，与模型组比较，依那普利组的收缩压与舒张压均显著下降（P＜0.05）。见表2、3。

2.2 依那普利对SHR 大鼠血清AngⅡ及肾功能的影响 与对照组比较，模型组AngⅡ、BUN、CysC 和尿mALB 水平均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，依那普利组上述指标均显著下降（P＜0.05），见表4。

2.3 依那普利对SHR 肾脏形态结构的影响 Masson 染色结果显示，对照组大鼠肾组织中可见少量蓝色的胶原纤维沉积，模型组大鼠肾组织出现大量蓝色胶原纤维沉积，依那普利组的胶原纤维沉积程度较模型组明显减轻，见图1。

2.4 依那普利对SHR大鼠肾组织中AngⅡ、TGF-β1及下游纤维化标志物的mRNA表达的影响 与对照组比较，模型组Ang Ⅱ、TGF-β1、Smad2、Smad3、CollagenⅠ和Collagen Ⅳ的mRNA 相对表达量明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，依那普利组的AngⅡ、TGF-β1、Smad2、Smad3、CollagenⅠ和Collagen Ⅳ的mRNA的相对表达量明显降低（P＜0.05），见表5。

Tab.2 Changes of systolic blood pressure during the experiment in three groups of rats表2 3组大鼠实验期间收缩压的变化（n=10，mmHg，±s）

Tab.2 Changes of systolic blood pressure during the experiment in three groups of rats表2 3组大鼠实验期间收缩压的变化（n=10，mmHg，±s）

＊＊P＜0.01；F组间=964.381＊＊，F时间=23.023＊＊，F交互=47.534＊＊；组间比较：a与对照组相比，b与模型组相比，P＜0.05；组内比较：A与0周相比，B与2周相比，C与4周相比P＜0.05；1 mmHg=0.133 kPa

干预时间组别对照组模型组依那普利组F 0周132.10±5.72 177.50±6.98a 173.50±5.19a 174.813＊＊2周135.10±5.15 192.50±6.64aA 148.40±6.19abA 248.772＊＊4周138.40±5.72A 197.70±8.26aA 148.60±8.38abA 176.138＊＊6周139.70±8.92A 192.00±7.09aA 141.70±8.81bABC 127.05＊＊8周142.60±6.40A 195.20±5.16aA 144.60±6.31bA 248.243＊＊10周143.70±5.03A 195.10±6.81aA 144.20±5.53bA 255.795＊＊F 4.932＊＊11.074＊＊29.136＊＊

Tab.3 Changes of diastolic blood pressure during the experiment in three groups of rats表3 3组大鼠实验期间舒张压的变化（n=10，mmHg，±s）

Tab.3 Changes of diastolic blood pressure during the experiment in three groups of rats表3 3组大鼠实验期间舒张压的变化（n=10，mmHg，±s）

＊＊P＜0.01；F组间=4.703＊＊，F时间=2.190，F交互=279.106＊＊；组间比较：a与对照组相比，b与模型组相比，P＜0.05；组内比较：A与0周相比，B与2周相比，P＜0.05

组别对照组模型组依那普利组F干预时间0周113.60±7.93 143.80±7.52a 139.00±4.22a 57.532＊＊2周112.20±6.09 148.10±8.09a 125.30±5.76abA 73.002＊＊4周116.70±6.34 146.10±9.89a 126.50±8.87abA 30.996＊＊6周118.50±5.78B 141.00±8.81a 121.20±7.80bA 25.053＊＊8周117.70±6.58 141.00±6.86a 121.90±5.63bA 37.889＊＊10周117.70±8.15 146.50±4.84a 120.90±7.78bA 49.714＊＊F 1.382 1.420 10.003＊＊

Fig.1 Effects of enalapril on renal fibrosis in SHR(Masson staining,×200)图1 依那普利对SHR肾纤维化的影响（Masson染色，×200）

Tab.4 Comparison of serum AngⅡ,BUN,CysC and mALB levels between three groups表4 3组大鼠血清AngⅡ、BUN、CysC、尿mALB水平的比较（n=10，±s）

Tab.4 Comparison of serum AngⅡ,BUN,CysC and mALB levels between three groups表4 3组大鼠血清AngⅡ、BUN、CysC、尿mALB水平的比较（n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a与对照组相比，b与模型组相比，P＜0.05

组别对照组模型组依那普利组F AngⅡ（ng/L）72.93±5.00 158.31±12.14a 83.19±12.35b 100.362＊＊BUN（mmol/L）4.60±0.56 7.92±2.09a 5.40±0.98b 9.564＊＊CysC（μg/L）128.37±6.31 156.45±13.50a 135.96±11.59b 10.178＊＊尿mALB（mg/L）4.69±1.31 8.08±1.56a 5.39±0.85b 7.980＊＊

Tab.5 Changes of AngⅡ,TGF-β1,Smad2,Collagen Ⅰand Collagen ⅣmRNA in three groups表5 3组大鼠肾组织AngⅡ、TGF-β1、Smad2、Smad3、CollagenⅠ和CollagenⅣ的mRNA表达变化（n=10，±s）

Tab.5 Changes of AngⅡ,TGF-β1,Smad2,Collagen Ⅰand Collagen ⅣmRNA in three groups表5 3组大鼠肾组织AngⅡ、TGF-β1、Smad2、Smad3、CollagenⅠ和CollagenⅣ的mRNA表达变化（n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a与对照组相比，b与模型组相比，P＜0.05

组别对照组模型组依那普利组F AngⅡ1.08±0.33 2.16±0.40a 1.24±0.31b 8.332＊＊TGF-β1 1.00±0.09 2.27±0.50a 1.39±0.50b 7.564＊＊Smad2 1.01±0.16 3.95±0.90a 1.39±0.86b 14.143＊＊组别对照组模型组依那普利组F Smad3 1.00±0.28 2.88±0.88a 1.37±0.41b 8.548＊＊collagenⅠ1.01±0.18 3.74±0.68a 1.26±0.37b 32.602＊＊collagenⅣ1.06±0.49 3.78±1.03a 1.28±0.32b 14.465＊＊

3 讨论

肾脏既是血压调控的重要器官，也是高血压损伤的靶器官之一。血压的升高会导致血管内皮功能损伤和肾脏缺血，使肾脏中RAAS 激活。AngⅡ是RAAS 中最重要的效应物，可通过作用于血管内皮细胞等细胞上的AT1R，激活一系列酶蛋白，直接或间接引起血管平滑肌细胞收缩、促进醛固酮的分泌、引起血管重塑、兴奋交感神经，从而导致血压升高，并发挥促炎症反应、促纤维化效应。有研究认为RAAS激活是造成肾脏损害的初始因素［8］。

长期的高血压使肾血管阻力增加，结构发生改变，肾小动脉管壁增厚，管腔狭窄，肾血流量逐渐减少，最终引起肾脏缺血性损害，尿微量白蛋白增加，出现蛋白尿。BUN 是临床常用的肾功能检测指标。CysC可自由通过肾小球滤过膜，并在肾近曲小管被重吸收和分解，当肾小球出现损伤时，CysC 水平会升高［9］。因此，CysC也是评价早期肾功能损伤和肾小球滤过功能下降的重要指标。本实验中血压监测及血、尿检测结果显示，模型组的血压以及AngⅡ、BUN、CysC、尿mALB 较对照组均出现升高，提示随着血压的升高，RAAS激活，造成了SHR肾脏功能损伤和肾小球滤过功能下降。给予依那普利后，上述指标均明显改善并恢复至接近正常水平，表明依那普利可能通过抑制RAAS 的激活，使SHR 的血压下降，并对高血压引起的肾小球损伤有保护作用。

肾脏的纤维化也被认为是反映肾功能损伤程度的主要指标，是各种进行性肾脏疾病的共同终点，主要表现为细胞外基质（ECM）的过度沉积［10］。研究指出，AngⅡ能够导致肾纤维化［11］，其机制可能与其能诱导TGF-β1等促纤维化因子的表达有关［12］。有研究表明，TGF-β1是可促使胶原等ECM生成增加、降解减少，导致肾纤维化、肾功能受损最关键的细胞因子［13］。目前研究证实TGF-β1/Smads 信号通路是TGF-β1行使其功能的主要通路，也是肾纤维化的主要通路［14-15］。经典TGF-β/Smads信号通路的激活过程大致为：TGF-β1 首先与其Ⅱ型受体结合，后者出现二聚化并导致自身的磷酸化，磷酸化的Ⅱ型受体进一步磷酸化TGF-β1 的Ⅰ型受体，导致Ⅰ型受体丝氨酸/苏氨酸激酶激活，从而特异性识别并激活Smad2和Smad3，激活后的Smad2/3与受体解离并与细胞质内Smad4结合，形成异源复合物，转导进入细胞核，激活数种促纤维化因子，促进纤维化［15-16］。

本研究病理结果显示，SHR 肾脏中大量胶原纤维沉积，发生明显的纤维化，提示血压的持续升高导致肾脏的纤维化，依那普利组的纤维化程度减轻。qRT-PCR 结果显示模型组肾脏组织中AngⅡ的mRNA 相对表达量较对照组显著升高，TGF-β1、Smad2、Smad3、CollagenⅠ和CollagenⅣ的mRNA 表达也有明显增加，表明模型组肾脏在高AngⅡ水平的刺激下，TGF-β/Smads 通路被激活，ECM 生成增多，发生了纤维化。而依那普利组的上述指标均较模型组下降，提示依那普利可通过降低肾组织中AngⅡ的水平，抑制TGF-β/Smads 信号通路的激活与传导，降低纤维化相关因子的表达，改善肾纤维化。

如今各国的指南中都将ACEI 作为临床降压的基础药物，且有研究证实高血压在发病初始阶段即会对靶器官造成损伤，建议在高血压早期就关注并采取措施，防止高血压介导的器官损害的发展［17］。本研究证实，在SHR 高血压的早期即进行干预，ACEI 可以通过阻断AngⅡ对肾脏的作用，在降压的同时减轻高血压引起的肾脏损伤，显著改善肾纤维化，其作用机制可能与降低AngⅡ水平、抑制TGF-β/Smads 信号通路的表达有关。目前的研究发现除RAAS 外，高血压引起的肾脏纤维化还可能与上皮间质转化（EMT）［18］、炎症反应和氧化应激［19］、MicroRNA 的调控［20］等有关。ACEI在上述的机制和通路中发挥何种作用还有待深入研究。