母婴血型不合新生儿溶血病IgG抗体亚型分析*

马印图 王更银 李烛 张怡 杨晓亚 李莉华

母婴血型不合新生儿溶血病(hemolytic disease of the newborn，HDN)是由于孕母和胎儿血型不同引起的溶血病，胎儿红细胞进入母体内刺激孕母产生针对血型抗原的特异性IgG抗体，这些抗体再通过胎盘屏障进入胎儿血液循环，进而导致胎儿红细胞溶解破坏，造成产后新生儿贫血、黄疸，严重者导致流产、死胎、产后新生儿出现高胆红素血症甚至死亡等严重后果。有文献报道因胎母血型不合而引起新生儿黄疸的发生率在30%～60%之间，差异的产生与HLA基因多态性和检测方法的不同有关[1，2]。有些孕产妇产前血型抗体效价很高，但产后新生儿却没有发生明显的溶血现象，说明抗体水平不是早期治疗的唯一指标,胎儿溶血的严重程度与抗原抗体反应的亲和力、胎盘屏障的保护作用、血型物质含量等多种因素有关，还与IgG抗体的亚型有很大关系。有国内外文献报道在Rh血型系统引起的HDN中,孕母血清中IgG1和IgG3亚型的含量与新生儿高胆红素血症危重程度有密切的相关性[3]。目前临床上IgG抗体亚型的检测技术主要有流式细胞仪和ELISA方法，二者均为进口试剂，价格昂贵，存在检测时间长、程序繁琐等缺点，我们采用自主研发的微柱凝胶技术检测血型抗体IgG亚型的试验方法[4]对高效价孕妇及其产后新生儿血液标本进行了IgG亚型分析,结果显示孕妇血型抗体IgG亚型含量与HDN的发生确有一定的相关性，与文献报道的结果基本一致，对早期个体化精准干预治疗母婴血型不合新生儿溶血病具有指导意义，现将分析结果报道如下。

资料与方法

1 病例资料 选取2018年1月～9月在我院产科孕检的高效价孕妇50名，其中ABO系统孕妇41例，其血清中IgG抗A(B)效价水平≥512, Rh阴性孕妇9例，IgG抗D效价≥32，孕妇年龄23～42岁，平均27.5岁，非近亲结婚，无输血史和家族遗传病史，其中32例新生儿的血液样本经溶血病三项试验和血生化指标检测，结合临床症状，诊断为新生儿高胆红素血症；8例孕妇血型抗体效价同样升高，但产后新生儿未出现HDN症状，作为对照组，两组分别进行了IgG亚型检测，同时对比观察高效价孕妇产后新生儿溶血情况，分析IgG各亚型与新生儿溶血病的相关性。

2 检测试剂与方法

2.1 试剂与仪器：抗-A、抗-B、抗-D、2-巯基乙醇（2-Me）、标准红细胞悬液(上海血液生物医药公司提供),总IgG及亚型微柱凝胶检测卡、专用离心机、孵育器（江苏力博医药生物技术股份有限公司提供）。

2.2 血型鉴定、总IgG抗体效价和溶血三项试验（直接抗球蛋白试验、游离抗体试验、抗体释放试验）以及HDN的临床诊断均严格按照文献进行[5，6]。

2.3 IgG亚型检测：采用微柱凝胶技术（microcolum gel technology assay，MGTA）,取IgG亚型微柱凝胶检测卡，做好标记，将待检标本血清采用2-Me进行37 ℃处理30 min以破坏血清中的IgM类抗体，然后进行倍比稀释4、8、16、32、……，在IgG亚型微柱凝胶检测卡中分别加入倍比稀释血清25 μL和0.8%A(B)型红细胞悬液50 μL，Rh阴性加入O型D阳性红细胞, 37 ℃条件下孵育15 min，专用离心机离心5 min,取出检测卡判读结果，以出现“2+”凝集的最高稀释度为抗体效价。

3 统计学处理 应用SPSS 13.0软件。孕妇IgG抗体效价与HDN发病率的关系采用χ2检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 IgG抗体效价与新生儿溶血病的相关性 50例高效价孕妇产后有32例新生儿临床出现了HDN的症状，其中ABO系统25例，Rh系统7例，结合溶血三项试验和胆红素指标确诊为新生儿高胆红素血症，而且发病率随IgG抗体效价水平升高而呈上升趋势(P＜0.05), 对照组8例同样抗体效价升高的孕妇其产后新生儿未发现HDN的症状，结果见表1。

表1 50例孕妇IgG抗体效价与HDN的发病情况（例）

2 IgG亚型与HDN的相关性 对高效价孕妇血清中总IgG以及各亚型效价检测结果进行比较，50例分娩后的新生儿有25例ABO系统发生了HDN,7例Rh系统发生了HDN，对照组8例孕妇血清中各亚型效价均较低，新生儿未出现HDN症状，高效价组HDN发病率为64.00%（32/50），结果见表2。

表2 孕妇血清总IgG以及各亚型效价检测结果比较（）

表2 孕妇血清总IgG以及各亚型效价检测结果比较（）

注： *与对照组比较，P＜0.05

类型 总IgG IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 HDN例数 发病率(%)ABO系（n=41） 抗-A 751.4±52.5 87.3±5.1 16 8 4 25 60.98*抗-B 722.7±46.3 81.4±2.9 16 4 2 Rh系统（n=9） 抗-D 109.7±12.8 69.7±1.8 16 4 4 7 77.78*

3 孕妇IgG亚型含量与产后新生儿溶血情况比较 在32例出现HDN的新生儿中有26例及其母亲血清中检出IgG1、IgG3的含量升高, 21例检出IgG1、IgG2的含量升高,均以IgG1为主,患儿及其母亲血清中IgG1和IgG3的含量比较，差异无统计学意义(P＞0.05),孕妇血清中IgG1和IgG3的含量,尤其是IgG1的含量与血型不合引起的HDN存在较大的相关性, 其中ABO系统7例Rh系统5例重度高胆红素血症新生儿，IgG3亚型明显增高进行了换血治疗，结果见表3。

表3 孕妇IgG亚型含量与新生儿溶血情况的比较

讨 论

孕期胎母血型不合可能引起产后新生儿高胆红素血症[7，8]。其发病原因主要是红细胞抗原与血型抗体结合而引起的免疫性溶血反应，孕母体内产生了针对父源的血型特异性抗体，这种抗体能够通过胎盘进入胎儿体内与红细胞结合，通过免疫细胞介导的细胞毒(ADCC)作用导致胎儿红细胞溶血[9]，新生儿发生HDN的轻重与血型抗体效价的高低、孕母免疫状态、胎盘屏障的保护作用等多种因素有关[10,11]，特别是IgG亚型与患儿危重程度关系密切[12，13]。IgG型抗体是唯一能够通过胎盘屏障的抗体，共有4个亚型，在血清中的浓度高低依次为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，其中IgG1亚型激活补体的能力最强，IgG3次之， IgG2和IgG4相对较弱。国内文献报道母体血清中IgG1和IgG3的含量,特别是IgG1的含量与ABO系统的HDN密切相关[14，15]。国外报道在Rh系统引起的HDN中, 检测发现IgG1是胎儿红细胞上致敏的主要抗体，占97%，IgG3占3%, 由此判断IgG1是主要的致病抗体,但病情的严重程度与IgG3有直接关系[16]。我们在临床实践中也发现，有些孕妇产前血型抗体效价很高，但产后新生儿溶血比较轻微，甚至未出现HDN症状，进一步检测发现其体内IgG1和IgG3的含量都不高，本研究结果也证实了上述观点，在产前夫妇抗体效价检测的过程中，无论是ABO血型系统的免疫性抗-A、抗-B还是Rh系统的抗-D抗体，如果孕妇血型抗体效价升高的同时IgG1含量也高，提示胎儿受累的可能性较大，若IgG3同步升高，则产后新生儿可能病情较重，换血的几率大大提高，如果仅是IgG2或/和IgG4升高，则胎儿病情轻微可能不需要早期干预治疗，基于以上结论，有必要针对抗体高效价的孕妇进一步测定IgG亚型的含量,对于预测产后新生儿高胆红素血症发生的几率及严重程度，有针对性地早期干预治疗具有指导意义。

目前临床实验室检测IgG抗体亚型的试剂盒均为进口试剂，价格昂贵、操作时间长、不利于普通实验室常规开展。近几年，微柱凝胶技术在血型与输血检测方面得到广泛应用[17，18]，我们通过在微柱凝胶卡的反应柱中包被IgG亚型的单抗试剂、筛选最佳凝胶微粒、对试验条件进行筛选与优化，成功建立了微柱凝胶技术检测血型抗体IgG亚型的试验方法，符合国家关于微柱凝胶检测卡的产品技术要求，经过临床标本检测验证，所建立的微柱凝胶技术检测血型抗体IgG亚型的试验方法简便、快速，实用性强，其特异性、重复性和稳定性较好，灵敏度高，所需仪器设备简单，普通实验室即可常规开展，对于及时分析、判断和早期干预治疗母婴血型不合HDN具有重要意义，值得临床实验室推广应用。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突