血站实验室新型冠状病毒相关检测平台的建立与安全防护*

张立波 戴宇东 庞蓉蓉 鲍晶晶 李燕 叶盛 仲昭衍 傅强

为积极开展新冠肺炎疫情防控[1]，探索有效的治疗方案，利用新冠肺炎康复者恢复期血浆开展临床治疗[2,3]，各地血站都已开始进行恢复期血浆标本的检测工作，但由于实验的复杂性，尤其抗体检测需要稀释及效价检测，往往采用人工的方式进行前处理，不容易实现标准化；且手工操作带来的生物安全风险问题无法避免[4-6]。我们依托于现用的血站实验室检测平台，建立了新型冠状病毒IgG、IgM抗体及核酸检测的自动化平台方案，使样本倍比稀释、前处理加样和核酸提取等步骤由设备自动化完成，为血站实验室开展恢复期血浆标本检测提供参考。

材料与方法

1 标本 新型冠状病毒肺炎康复者恢复期大于14天献血浆人员标本6例。

2 仪器与试剂 主要仪器：全自动加样器(STAR)、全自动酶免分析仪（FAME）、智能高速冷冻离心机（Thermo）、生物安全柜（Thermo）、荧光定量核酸扩增仪（ABI）。

主要试剂：新型冠状病毒IgM抗体检测试剂盒（珠海丽珠）、新型冠状病毒IgG抗体检测试剂盒（珠海丽珠）、新型冠状病毒ORF1ab/N/E基因核酸检测试剂盒（上海科华）。

3 方法

3.1 实验室新冠病毒相关检测平台工作流程见图1。

图1 实验室新冠病毒相关检测平台工作流程图

3.2 全自动加样器程序修改：在原有加样程序基础上增加新型冠状病毒IgM、IgG抗体检测。IgM抗体检测按照说明书操作，在加样位放置与样本数相同的洁净试管，加样器取1 mL稀释液加入洁净试管后吸取10 μL血清加入，为避免气溶胶，采用液面下混匀吸吐800 μL，混匀6次后加样；IgG抗体检测按照说明书操作，在微板位放置96孔稀释板，加样器先在反应板样本孔加入100 μL稀释液，再在稀释板加入正常人阴性血清作为稀释剂：横向第1孔加入270 μL，其余6孔各加入100 μL。取样本血清35 μL，将5 μL加到反应板，在稀释液液面下加样。其余30 μL加到稀释板第1孔，液面下吸吐250 μL进行6次混匀，之后取105 μL分配至反应板5 μL，剩余100 μL移至稀释板第2孔进行倍比稀释，同样采用液面下吸吐150 μL进行6次混匀。按照第1孔方式取105 μL加样5 μL，其他各孔以此类推最终形成1∶10至1∶320稀释倍数加样。

3.3 全自动酶免分析仪程序编辑：按照说明书要求进行实验。

3.4 全自动核酸提取程序的修改：现有检测的核酸模板提取程序不变，核酸提取完毕后使用增加的新程序将模板分配至SARS-CoV-2扩增板后加入阳性对照、阴性对照、引物探针及核酸扩增反应液，封板后使用新编辑的SARS-CoV-2扩增程序进行扩增。试剂内标选用一对管家基因特异性引物，结合特异性探针，用于检测过程监控，不影响HBV-DNA、HCV-RNA和HIV-RNA提取及扩增反应，可检测新型冠状病毒ORF1ab基因、N基因和E基因。根据说明书要求进行结果判断。

3.5 LIS系统方法编辑：根据说明书及结果在LIS系统编辑各实验方法，接收各检测设备传输的信息及结果进行整合，打印及发送报告。

3.6 实验安全防护：工作人员全程按照生物安全二级防护：佩戴N95口罩、护目镜、乳胶手套、鞋套、工作服外加穿医用防护服、医用防护帽，如有接触样本或相关载架及时用酒精进行手卫生消毒。对实验过程中所用的稀释板和试管进行贴封板纸及加胶塞密封处理，接触到的试管架等用酒精消毒。实验室结束加样设备关闭电源后，使用酒精喷壶对设备表面、弃针位等风险区域进行消毒处理，之后用移动式紫外线消毒车照射30 min。生化仪、血型仪等设备按相同方式处理；全自动酶免分析仪配套消毒液deconex 61 DR可灭活HIV、HBV等包膜病毒，按照说明书要求使用60℃热蒸馏水配置稀释消毒液进行消毒维护。最后对本试验产生的医疗垃圾及检测样本进行高压消毒处理，实验室按要求进行清洁消毒[7,8]。

结 果

1 新型冠状病毒IgM抗体检测结果 两次试验阴性对照与阳性对照结果与预期值相一致，同时6例新型冠状病毒肺炎康复者恢复期血浆的IgM抗体检测结果都为阳性，多数结果S/CO值在3之下，为弱阳性，1例结果S/CO值大于3，阳性值较高，具体结果见表1、表2。

表1 两次试验新型冠状病毒IgM抗体试剂阴性对照与阳性对照结果

表2 6例新型冠状病毒肺炎康复者恢复期血浆IgM抗体检测结果

2 新型冠状病毒IgG抗体检测结果 两次试验阴性对照与阳性对照结果与预期值相一致，6例新型冠状病毒肺炎康复者出院时间都超过14天，最长者达23天，恢复期血浆的IgG抗体效价绝大多数大于1∶160，具体结果见表3、表4。

3 新型冠状病毒RNA检测结果 两次试验阴性对照与阳性对照结果与预期值相一致，内标结果正常，6例新型冠状病毒肺炎康复者恢复期血浆病毒RNA检测结果都为阴性，结果见表5。

表3 两次试验新型冠状病毒IgG抗体试剂阴性对照与阳性对照结果

表4 6例新型冠状病毒肺炎康复者恢复期血浆IgG抗体检测结果

表5 两次试验新型冠状病毒核酸试剂检测结果

讨 论

从表1、表2可以看出从自动化设备加样到酶免检测分析，所建立的平台新型冠状病毒IgM抗体试剂各对照结果符合预期值，康复者恢复期标本IgM抗体可以良好的被检出。同时可看到新冠肺炎康复者出院14天后IgM抗体没有消失，仍为阳性，分析可能原因为IgM抗体在体内存在很长时间。5例结果都是弱阳性，说明康复者在恢复期IgM抗体已经持续下降接近消失，1例IgM抗体阳性值较高，可能与该康复者体内病毒感染持续时间较长有关。

从表3、表4也可以看出所建立的平台新型冠状病毒IgG抗体试剂各对照结果均符合预期值，康复者恢复期标本IgG抗体可以良好地被检出，可以自动化进行倍比稀释来检测IgG抗体相对效价。6例新冠肺炎康复者出院14天IgG抗体都已经产生，康复者有了持续的免疫力，有5例抗体效价都超过1∶320，1例效价不高，大于1∶40小于1∶80。

从表5可以看出，康复者血液内都不存在新冠肺炎病毒核酸，所建立的检测平台对新型冠状病毒的阳性对照3个基因可以良好的检出。结合表2、表4，患者都已经处于恢复期，具有一定的免疫力。以上结果还提示我们, 采用恢复期血浆疗法时, 是否要考虑IgM抗体必须是阴性，或抗体阳性在何种范围不能用于患者的治疗，或进一步延长康复者出院后的的血浆采集时间，这样的疗效可能更好。下一步我们还将继续收集检测数据判断出院后多长时间抗体检测值及效价最高，为临床使用康复者恢复期血浆治疗提供数据参考。

综上所述，本研究构建了一个自动化、标准化的加样与检测新型冠状病毒相关检测平台，可以完成血站实验室对新型冠状病毒肺炎康复者恢复期血浆标本的筛查工作，同时可避免生物安全风险，提高检测效率，尤其为IgG抗体效价检测提供了便利的条件。利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突