鲜食白木纳格蒸馏酒的发酵工艺优化

王浩臣,马吉祥,陈新军,李学文,杨晓君,宋晶晶,赵 昊,武 运,*

(1.新疆农业大学食品科学与药学学院,新疆乌鲁木齐 830052;2.新疆中信国安葡萄酒业有限公司,新疆昌吉 832200)

木纳格葡萄(VitisviniferaL. cv.Munage),又名冬葡萄、戈壁葡萄。欧亚种,分为红木纳格和白木纳格株系,粒大、皮薄、色泽鲜艳、口味甘美、果肉厚而脆,可切片,“木纳格”,即维吾尔族语“晶莹透亮”的意思[1],是最具新疆特色和地域性的鲜食、晚熟地方品种[2]。2004年,木纳格葡萄产量为14.46万吨[3],2014年达到28.55万吨[4],十年期间总产量翻了近一倍,为新疆地区发展较为迅猛的葡萄品种之一。而我国鲜食葡萄产品以满足国内市场需求为主,但由于鲜食葡萄自身不耐贮运的属性,加之替代产品丰富,鲜食葡萄集中上市导致阶段性供过于求[5],会有大量鲜食葡萄资源浪费,所以本研究选以鲜食白木纳格葡萄作为原料,经发酵、蒸馏作为饮品,可以减少资源浪费。

酒中所含的甲醇和杂醇油能与有机酸结合成酯,使酒具有独特的香味,但又会带有一定的毒性[6]。甲醇对人体中枢神经有抑制的作用,尤其对视网膜神经系统具有一定的毒性,在人体内累积,会导致眼睛失明[7]。而高级醇尤其是异丁醇和异戊醇对人体中毒作用与麻醉作用比乙醇还强,其毒性会随分子量的增加而增大,能引发头痛头痛恶心等症状,并且长期摄入导致慢性中毒[8-9]。刘跟生等[10]用游离脂肪酸相(FFAP)毛细管柱直接进样测定自酿白酒中甲醇,操作简单,样品未进行处理直接进样。童永鑫等[11]用气相色谱法测定石榴葡萄酒中的甲醇和杂醇油,具有较高的精密度。出于安全性和产品风味的考虑,须控制蒸馏酒中甲醇和杂醇油中异丁醇和异戊醇的含量。

目前,针对工艺优化的方法主要有正交试验和响应面优化试验等。李洁等[12]通过单因素实验和正交试验确定木薯渣发酵生产生物饲料的最佳工艺。张少云等[13]通过单因素和响应面试验确定红枣蒸馏酒发酵的最佳工艺。王芳等[14]采用单因素和响应面法优化法确定茶叶梗发酵生产单宁酶的最佳工艺。最终优化出最佳工艺参数的试验值和预测值基本相同,说明建立的模型符合实际生产。因此,使用响应面法能够快速准确地找到影响发酵工艺的主要参数,确定主要参数的值,提高优化的准确性。随着人们生活水平的提高和保健意识的增强,需要适当减少蒸馏酒中甲醇和杂醇油中异丁醇和异戊醇的含量[15]。本研究以鲜食白木纳格葡萄为原料,用鲜食白木纳格发酵原液的甲醇含量和异丁醇异戊醇总含量及酒精度作为考察指标,通过单因素实验和响应面试验优化鲜食白木纳格发酵工艺参数,为鲜食白木纳格蒸馏酒的制作提供理论和实践依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鲜食白木纳格葡萄(初始糖度17.0 Brix,pH=3.54) 新疆九鼎农产品批发市场;安琪葡萄酒果酒专用酵母 安琪酵母股份有限公司;偏重亚硫酸钾 北京奥博星生物技术有限责任公司;果胶酶(酶活8600 PGNU/g) 法国拉氟德公司;甲醇、异丁醇、异戊醇 天津市致远化学试剂有限公司;所有试剂 均为国产色谱纯。

FA2014N分析天平 北京东南仪诚实验室设备有限公司;MJX-160-Z霉菌培养箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;LDZX-50KB型立式蒸汽灭菌器 上海申安医疗器厂;PAL-1型手持糖度计 北京阳光亿事达科技有限公司;SXKW数显控温电热套 北京市永光明医疗仪器厂;SB6 L三步精馏器 烟台市吉讯酿酒设备加工厂;HP6890N气相色谱仪 上海普迪生物技术有限公司;SDCP-5葡萄除梗破碎机 山东诸城酒庄酿酒设备制造厂;50 L气囊压榨机 山东诸城酒庄酿酒设备制造厂。

1.2 实验方法

1.2.1 鲜食白木纳格净汁的制备 鲜食白木纳格葡萄经清洗、除梗、压榨取汁,分别添加0.02 g/L果胶酶,0.05 g/L的偏重亚硫酸钾,10～12 ℃澄清24 h[16],取鲜食白木纳格净汁进行后续试验。

1.2.2 鲜食葡萄蒸馏酒的制备 使用SB6 L三步精馏器进行蒸馏,加入12 L在18 ℃接种量0.03%,发酵7 d的鲜食白木纳格发酵液,蒸馏釜功率旋钮调到最大,混液蒸馏釜温度达到80 ℃或者刚以出酒,将电源关闭。出酒40%～50%vol时,关闭电源,废液排掉后,将混液提馏锅中的酒液放入蒸馏锅、预热器中的酒液放入混液提馏锅中。再将预热器打满原料酒。后续操作重复操作直至最后一次出酒。

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 发酵温度对鲜食白木纳格发酵原液的影响 称取1 L鲜食白木纳格净汁以接种量0.02%、发酵时间7 d,分别在14、18、22、26、30 ℃条件下进行发酵,发酵结束后测定发酵液的甲醇含量、异丁醇和异戊醇总含量及酒精度,考察发酵温度对鲜食白木纳格发酵的影响。

1.2.3.2 发酵时间对鲜食白木纳格发酵原液的影响 称取1 L鲜食白木纳格净汁以接种量0.02%、发酵温度22 ℃,分别在4、5、6、7、8 d条件下,进行发酵,发酵结束后测定发酵液的甲醇含量、异丁醇和异戊醇总含量及酒精度,考察发酵时间对鲜食白木纳格发酵的影响。

1.2.3.3 不同酵母接种量对鲜食白木纳格发酵原液的影响 称取1 L鲜食白木纳格净汁以发酵温度22 ℃,发酵时间7 d,分别在接种量0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%条件下进行发酵,发酵结束后测定发酵液的甲醇含量、异丁醇和异戊醇总含量及酒精度,考察接种量大小对鲜食白木纳格发酵的影响。

1.2.4 响应面试验 在单因素实验基础上,选取对甲醇含量、异丁醇和异戊醇总含量及酒精度影响较大的发酵时间(A)、发酵温度(B)、接种量(C)为考察因子,以发酵液的甲醇(Y1)、异丁醇和异戊醇总量(Y2)和酒精度(Y3)为响应值,利用响应面软件Design Expert V8.0.6进行响应面优化试验设计。

1.2.5 酒精度和甲醇、异丁醇、异戊醇含量的测定

1.2.5.1 酒精度的测定 参照GB 5009.225-2016 《酒中乙醇浓度的测定》方法[17]。

1.2.5.2 甲醇和异丁醇、异戊醇的测定方法 使用毛细管柱气相色谱法通过HP6890N气相色谱仪测定,准备溶液用称量法分别准确称取甲醇、异丁醇、异戊醇0.4722、0.4506、0.4470 g于预先储盛有20 mL纯水的100 mL容量瓶中,用纯水洗瓶口,并加水稀释至刻度,置冰箱保存。

1.2.5.3 标准曲线绘制 于3支预先盛有2 mL 60%乙醇的10 mL容量瓶中,分别加入0.250、0.500、1.000 mL标准储液,用60%乙醇稀释至刻度。此时甲醇浓度为0.0012、0.0024、0.0047 mg/ml,异丁醇浓度为0.0011、0.0023、0.0045 mg/mL,异戊醇浓度为0.0011、0.0022、0.0045 mg/mL[18]。

1.2.5.4 样品测定 汽化室温度为250 ℃[19];检测器温度为250 ℃;选用高纯氮气作载气,载气压力为10 kPa,选择分流进样方式,分流旋钮5圈;进样体积为1 μL;程序升温为:35 ℃保持5 min[18],再7 ℃/min升至90 ℃,保持5 min[20]。色谱图的横坐标为出峰时间、纵坐标为峰高,利用所制作的标准曲线来计算出样品中甲醇、异丁醇和异戊醇的含量。

1.3 数据处理

通过Excel 2018软件以及响应面软件Design Expert V 8.0.6进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 发酵温度对鲜食白木纳格发酵液中甲醇含量、异丁醇和异戊醇总含量及酒精度的影响 杂油醇产生的主要原因是发酵中间产物即丙酮酸生成的。丙酮酸经复杂的中间阶段生成酮酸,再经脱羧主要还原成异丁醇和异戊醇等[21]。所以本研究将异丁醇及异戊醇的总和一起计算。由图1可知,发酵温度过高或过低都不利于酵母菌的生长代谢。当发酵温度为14 ℃时,发酵液酒精度含量较低,甲醇含量与异丁醇和异戊醇总含量开始下降。当发酵温度为18 ℃时,发酵液中酵母菌快速生长,此时鲜食白木纳格发酵液的酒精度达到最高,为10.0%vol,甲醇含量为0.0015 mg/mL,异丁醇和异戊醇总含量为0.012 mg/mL,当发酵温度为22 ℃时,酒精度较开始持续下降,可能是由于发酵温度较高,抑制了酵母菌的生长,同时加速了酵母菌的衰亡,此时酵母菌不再是发酵基质中的优势菌群所导致,此时甲醇含量与异丁醇和异戊醇总含量均为最高,分别是0.006和0.013 mg/mL,并开始下降。综合考虑,选择发酵温度18 ℃为宜。

图1 发酵温度对鲜食白木纳格发酵原液甲醇含量、异丁醇和异戊醇总含量及酒精度的影响Fig.1 Effect of fermentation temperature on methanol content,total content of isobutylalcohol and isoamyl alcohol and alcoholcontent in fresh-edible White Munage fermentation solution

2.1.2 发酵时间对鲜食白木纳格发酵液中甲醇含量、异丁醇和异戊醇总含量及酒精度的影响 由图2可知,当发酵时间为4 d时,发酵液的酒精度含量较低,这可能是因为在4 d内酵母菌处于迟缓期,其代谢系统需要适应新的培养环境。当发酵时间在5～7 d时,发酵液的甲醇含量、异丁醇和异戊醇总含量及酒精度不断上升,可能是因为在发酵5 d后,酵母菌生长进入稳定期,加快了糖转化为酒精的速率,使得在7 d时酒精度达到最高为9.8%vol,此时甲醇含量,异丁醇和异戊醇总含量分别达到0.006和0.013 mg/mL,但当发酵时间超过7 d后,酵母菌的生长进入了衰亡期,酒精度有所下降,但异丁醇和异戊醇总含量仍然在上升,甲醇含量有所减少。综合考虑,发酵时间选择7 d为宜。

图2 发酵时间对鲜食白木纳格发酵原液甲醇含量、异丁醇和异戊醇总含量及酒精度的影响Fig.2 Effect of fermentation time on methanol content,totalcontent of isobutylalcohol and isoamyl alcohol and alcoholcontent in fresh-edible White Munage fermentation solution

2.1.3 接种量对鲜食白木纳格发酵原液中甲醇含量、异丁醇和异戊醇总含量及酒精度的影响 由图3可知,当接种量较少时,接入的酵母菌在鲜食白木纳格发酵液中需要适应期,使得发酵液的甲醇含量、异丁醇和异戊醇总含量及酒精度都较低。当酵母菌接种量为0.02%时,鲜食白木纳格发酵液的甲醇含量、异丁醇和异戊醇总含量达到最高值,分别为0.006和0.013 mg/mL,此时酒精度为9.8%vol。当接种量大于0.02%时,甲醇含量与异丁醇和异戊醇总含量开始持续下降,酒精度在0.04%时达到最大,为10.2%vol。在生产中接种量过高会增加成本;异丁醇和异戊醇同属高级醇,虽是有害物质,但却是构成蒸馏酒中香气的主要物质,而此时异丁醇和异戊醇含量均符合标准。综合考虑,发酵液的接种量选择0.03%为宜。

图3 接种量对鲜食白木纳格发酵原液甲醇含量、异丁醇和异戊醇总含量及酒精度的影响Fig.3 Effects of inoculum size on methanol content,totalisobutylalcohol and isoamyl alcohol content and alcoholcontent in fresh-edible White Munage fermentation broth

2.2 鲜食葡萄蒸馏酒发酵条件的优化

2.2.1 响应面试验设计与结果 根据单因素实验的结果,综合考虑选取以发酵时间(A)、发酵温度(B)、接种量(C)为自变量,以鲜食白木纳格发酵液的甲醇(Y1)、异丁醇和异戊醇总含量(Y2)和酒精度(Y3)为响应值,进行3因素3水平试验。

鲜食白木纳格蒸馏酒发酵响应面试验设计与结果如表2所示,回归模型方差分析结果见表3、表4和表5所示。根据表1试验结果,进行多元回归方程拟合,建立以鲜食白木纳格发酵液的甲醇为评价指标的拟合方程为:甲醇(Y1)=2.2E-3-8.75E-4A+6.25E-4B-5E-4C-2.5E-4AB+1E-3AC-5E-4BC+5.25E-4A2+1.525E-3B2+7.75E-4C2。

表1 响应面试验因素水平表Tabie 1 Factors and levels of response surface methodology

表2 鲜食白木纳格发酵条件响应面试验设计结果与分析Table 2 Experimental design and analysis of response surface in fermentation conditions of fresh-edible White Munage

以鲜食白木纳格发酵液中异丁醇和异戊醇总量为评价指标的拟合方程为:异丁醇和异戊醇总含量(Y2)=5.2E-3+5E-4A+6.25E-4B-1.125E-3C+5E-4AB+2.5E-4BC+1.775E-3A2+1.525E-3B2+1.525E-3C2。

以鲜食白木纳格发酵液的酒精度为评价指标的拟合方程为:酒精度(Y3)=10+0.21A+0.16B+0.12C+0.075AB+0.05AC+0.05BC-0.19A2-0.14B2-0.012C2。

表3 以鲜食白木纳格发酵液甲醇含量为评价指标响应面试验结果的方差分析Table 3 The response surface test results and variance analysis are based on the content offresh-edible White Munage fermentation liquid methanol as the evaluation index

表4 以鲜食白木纳格发酵液异丁醇和异戊醇总含量为评价指标响应面试验结果及方差分析Table 4 Response surface test results and analysis of variance based on the total contents ofisobutylalcohol and isoamyl alcohol in fresh-edible White Munage fermentation broth

各项方差分析结果表明,模型中的一次项A、B、C,交互项AC,平方项B2、C2对鲜食白木纳格发酵液的甲醇含量影响为极显著(P<0.01)。根据3个因素的F值可以推测,3个因素对鲜食白木纳格发酵甲醇含量的影响主次顺序为:A>B>C,即发酵时间对鲜食白木纳格发酵液的甲醇含量影响最大,其次是发酵温度,再其次是接种量对其影响最小。由交互项F值可以判断,发酵时间和接种量(AC)的交互作用对鲜食白木纳格发酵液甲醇含量的影响为极显著(P<0.01),其中发酵温度和接种量(BC)影响鲜食白木纳格发酵液甲醇含量的交互作用大于发酵时间和发酵温度(AB)的交互作用。

各项方差分析结果表明,模型中的一次项A、B、C,平方项A2、B2、C2对鲜食白木纳格发酵液的异丁醇和异戊醇总含量影响为极显著(P<0.01)。根据3个因素的F值可以推测,3个因素对鲜食白木纳格发酵液的异丁醇和异戊醇总含量的影响主次顺序为:C>B>A,即接种量对鲜食白木纳格发酵液中的异丁醇和异戊醇总含量影响最大,其次是发酵温度,再其次是发酵时间对其影响最小。由交互项F值可以判断,发酵时间和发酵温度(AB)的交互作用对鲜食白木纳格发酵液中异丁醇和异戊醇总含量的影响为较显著(P<0.05),其中发酵温度和接种量(BC)影响鲜食白木纳格发酵液中异丁醇和异戊醇总含量的交互作用大于发酵时间和接种量(AC)的交互作用。

表5 以鲜食白木纳格发酵液酒精度为评价指标响应面试验结果及方差分析Table 5 Response surface test results and analysis of variance based on alcohol precision offresh-edible White Munage fermentation broth as evaluation indexes

各项方差分析结果表明,模型中的一次项A、B、C,平方项A2、B2对鲜食白木纳格发酵液的酒精度含量影响为极显著(P<0.01)。根据3个因素的F值可以推测,3个因素对鲜食白木纳格发酵液酒精度的影响主次顺序为:A>B>C,即发酵时间对鲜食白木纳格发酵液酒精度的含量影响最大,其次是发酵温度,再其次是接种量对其影响最小。由交互项F值可以判断,发酵时间和发酵温度(AB)的交互作用影响比发酵温度和接种量(BC)以及发酵时间和接种量(AC)的交互作用影响大,而发酵温度和接种量(BC)与发酵时间和接种量(AC)的交互作用影响类似。

2.2.2 响应面分析 为了考察各个交互项对鲜食白木纳格发酵液甲醇含量、异丁醇和异戊醇总含量及酒精度的影响,利用Design Expert V8.0.6软件对建立的回归方程计算,做出交互项的三维响应面图,如图4所示,图片能够清楚直观地解释各个变量之间的交互作用对响应值的影响。

图4 各因素交互作用对鲜食白木纳格发酵液甲醇含量与异丁醇和异戊醇总含量及酒精度的响应面Fig.4 Response surface of interaction of various factors to methanol content,total isobutylalcoholand isoamyl alcohol content and alcohol accuracy in fresh-edible White Munage fermentation broth

2.2.3 鲜食白木纳格蒸馏酒最佳发酵条件的验证试验 通过Design Expert V8.0.6软件对建立的回归方程进行发酵工艺参数的优化得到的鲜食木纳格发酵的最佳工艺为:发酵温度18 ℃、发酵时间7 d、接种量0.03%,在此发酵条件下预测鲜食白木纳格葡萄发酵液的甲醇含量为0.002 mg/mL,异丁醇和异戊醇总含量为0.005 mg/mL,酒精度为10.1%vol。为验证所建模型的准确性以及保证试验的可操作性,将鲜食白木纳格最佳发酵工艺条件调整为发酵温度为18 ℃、发酵时间7 d、接种量0.03%。得到的鲜食白木纳格发酵液的甲醇含量为0.002 mg/mL,异丁醇和异戊醇总含量为0.005 mg/mL,酒精度为10.0%vol。该发酵液蒸馏得到蒸馏酒的甲醇含量为0.038 mg/mL,异丁醇和异戊醇总含量为0.043 mg/mL,酒精度可达到44.0%vol。国家对果酒中的甲醇有明确的规定,《GB 15037-2006 葡萄酒》中限定葡萄酒中甲醇400 mg/L[22]。酒中杂油醇(以异丁醇与异戊醇计)限量0.20 g/100 mL[23]均符合标准。鲜食白木纳格发酵液实测值与预测值较为接近,说明试验建立的模型准确可靠,能较好地预测鲜食白木纳格发酵液的甲醇含量与异丁醇和异戊醇总含量及酒精度含量,利用该模型在实际生产中进行预测是可行的。

3 结论

试验以鲜食白木纳格发酵液的甲醇含量与异丁醇和异戊醇总含量及酒精度为响应值,对鲜食白木纳格的发酵条件进行优化,通过单因素实验以及Design Expert V8.0.6响应面优化建立了多元回归模型,得到鲜食白木纳格发酵液最优发酵条件为发酵温度18 ℃,发酵时间7 d,接种量0.03%,鲜食白木纳格发酵液的甲醇含量为0.002 mg/mL,异丁醇和异戊醇总含量为0.005 mg/mL,酒精度可达到10.0%vol,通过蒸馏后,该鲜食葡萄蒸馏酒的甲醇含量为0.038 mg/mL,异丁醇和异戊醇总含量为0.043 mg/mL,酒精度可达到44.0%vol。本研究采用响应面法,以鲜食白木纳格发酵液的甲醇、异丁醇和异戊醇总含量及酒精度为响应值对鲜食白木纳格葡萄的发酵工艺进行优化,通过本研究制备的蒸馏酒的甲醇、异丁醇、异戊醇含量均符合国家标准[24],能有效降低甲醇和异丁醇及异戊醇的总含量并提升酒精度,保证后续蒸馏制得的蒸馏酒的风味及安全性。