丹参酮ⅡA对大鼠心肌缺血再灌注损伤中HMGB1、IL-1β表达及SOD水平的影响∗

丁华胜 王永剑 黄忠毅

（南方医科大学深圳医院，广东 深圳 518101）

心肌缺血再灌注损伤（MI/R）仍为临床上最常见的病理生理过程。近年来研究证实，心肌缺血再灌注损伤机制中，自由基学说与炎性反应在MI/R发生发展中的重要性越来越受到重视。实验表明在急性MI/R时，血浆中脂质过氧化物（LPO）增多，而心肌中的超氧化物歧化酶（SOD）因合成减少、被灌注液带走以及消耗增加而减少，补充外源性的SOD可减轻氧自由基的损伤，从而降低致死性心律失常[1-2]。1973年，Coodwin等在牛胸腺中提取发现高迁移率族蛋白B1（HMGB1），HMGB1作为炎性介质由坏死细胞被动释放或激活的免疫细胞主动分泌至胞外[3]，并与其受体RAGE和TLR4结合，导致大量的炎性介质释放。从大量的研究资料中得到的数据分析，HMGB1在MI/R的过程中起到了一定的作用[4]。丹参酮ⅡA具有抑制心肌细胞肥大并保护心肌的作用，其机制可能与扩张血管、清除氧自由基、促进血液循环，进而发挥抗心肌缺血的作用有关[5-7]。本文通过观察丹参酮ⅡA在心肌中的作用以及观察对HMGB1、IL-1β、SOD的影响，以期为临床防治MI/R提供参考。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级SD雄性大鼠52只，体质量210～270 g，全部购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK（京）2016-0006。大鼠饲养环境：室温（22±2）℃，湿度（55±5）%，12 h/12 h昼夜周期，自由饮水与进食。适应性饲养4 d后进行实验。

1.2 试药与仪器 1）药物：丹参酮ⅡA磺酸钠注射液（上海第一生化药业有限公司，国药准字H31022558，2 mL︰10 mg）；戊巴比妥钠（山东鲁南制药厂）。2）试剂：IL-1β ELISA试剂盒[博士德生物工程公司（武汉）]；SOD试剂（南京建成生物科技有限公司）；HMGB1兔多克隆抗体（英国abcam公司）。2）仪器：低温高速离心机（Hitachi CF-5型，日本）；UV-2201型紫外分光光度计（日本岛津公司）；千分之一天平（METTLER公司）；显微镜（OLYMPUS）；动物呼吸机（浙江大学动物仪器厂）。

1.3 分组及造模 1）分组：实验大鼠随机分成假手术组、模型组、丹参酮ⅡA高、低剂量（16、8 mg/kg）组，各组均为13只。2）模型制备：根据参考文献[8]，将剂量为30 mg/kg的戊巴比妥钠通过腹腔注射麻醉大鼠，将大鼠仰位固定，气管插管后接人工呼吸机，在第四肋间开胸后，分离心包，暴露心脏后，将4-0丝线穿过左心耳下缘冠脉前降支起始部约3 mm处，在结扎线下置入乳胶管（φ0.15 cm），收紧结扎线后打结，阻断40 min后松开结扎线再灌注2 h。判断MI/R模型成功标志：结扎线后大鼠心电图标准导联显示ST-T抬高，丝线放松后抬高的ST-T下降。

1.4 干预方法 1）假手术组：在左心耳下缘冠脉前降支起始部约3 mm处穿线后10 min腹腔注射液生理盐水4 mL，再灌注2 h，不结扎冠脉。2）模型组：缺血前腹腔注射生理盐水4 mL，心肌缺血40 min后，再灌注2 h。3）丹参酮ⅡA低剂量组：缺血前10 min，腹腔注射丹参酮ⅡA磺酸钠注射液溶液4 mL（制备方法：丹参酮ⅡA磺酸钠注射液8 mg/kg兑入生理盐水配至4 mL）。4）丹参酮ⅡA高剂量组：缺血前10 min，腹腔注射丹参酮ⅡA磺酸钠注射液溶液4 mL（制备方法：丹参酮ⅡA磺酸钠注射液16 mg/kg兑入生理盐水配至4 mL）。以上4组大鼠成功造模后2 h立即处死，采集血液与心脏标本然后进行相关指标检测。

1.5 指标检测 1）梗死心肌面积的测定：于再灌注2 h结束后立即结扎冠状动脉，在颈动脉处注射伊文斯蓝1.5 mL，随后将心脏取下用缓冲液PBS进行冲洗，将脂肪、心房、血管等无关组织丢弃，用滤纸把左心室水分去除后放置在冰箱（温度-20℃）内进行冷冻处理。之后由心尖部向上将心脏切成厚度相等的5片，进行TTC染色，未被蓝染的为危险区（AAR），白色为梗死区（IS），由此得出梗死面积的百分比（IS/AAR×100%）。2）血清指标测定：再灌注2 h后，采集颈静脉血液标本，2 500 r/min离心处理15 min，取上层血清移至EP管内，置于低温冰箱（-20℃）内，借助分光光度计，采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力；采用ELISA法检测IL-1β的表达水平，具体操作按试剂盒说明书进行。3）免疫组化检测HMGB1蛋白表达：通过随机方式，每组选8只大鼠，取大鼠左心室缺血区，采用免疫组化检测HMGB1蛋白表达，在光镜下心肌细胞胞浆出现棕黄色均质颗粒为阳性。每张免疫组化切片随机选取5个高倍视野（400倍），利用Image ProPlus 5.0对阳性细胞染色的AIOD（平均积分光密度）值进行求解，此值与HMGB1蛋白含量呈正比关系。

1.6 统计学处理 应用SPSS18.0统计软件。计量资料以（）表示。多组之间比较采用单因素方差分析，组间比较采用q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠心肌梗死面积比较 见表1。与模型组比较，丹参酮ⅡA高、低剂量组心肌梗死面积均显著减小（均P＜0.05）。

表1 各组心肌梗死面积及血清IL-1β水平比较（±s）

表1 各组心肌梗死面积及血清IL-1β水平比较（±s）

与模型组比较，∗P＜0.05，∗P＜0.01；与假手术组比较，△P＜0.05。下同

组别假手术组模型组丹参酮ⅡA低剂量组丹参酮ⅡA高剂量组n 5 5 5 5心肌梗死面积（%）-35.71±3.49 31.29±3.01*28.16±3.27*IL-1β（pg/mL）126.43±23.34 489.54±103.76△431.02±65.27*△401.79±47.33*△

2.2 各组大鼠血清中IL-1β的表达比较 见表1。与假手术组比较，模型组大鼠血清IL-1β的表达水平明显升高（P＜0.01）。丹参酮ⅡA高、低剂量组血清IL-1β水平下降，与模型组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 各组大鼠心肌坏死区组织HMGB1蛋白水平及血清SOD水平比较 见表2，图1。1）HMGB1蛋白水平：丹参酮ⅡA两个剂量组HMBG1蛋白表达水平较模型组明显下降，模型组则较假手术组明显升高（P＜0.05）。2）SOD水平：模型组SOD水平较假手术组显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，丹参酮ⅡA两个剂量组SOD水平明显增高（P＜0.05或P＜0.01），表明丹参酮ⅡA可增强SOD的活性。

表2 各组大鼠心肌坏死区组织HMGB1蛋白表达及血清SOD水平比较（±s）

表2 各组大鼠心肌坏死区组织HMGB1蛋白表达及血清SOD水平比较（±s）

组别假手术组模型组丹参酮ⅡA低剂量组丹参酮ⅡA高剂量组n 8 8 8 8 HMGB1（AIOD）13.81±2.16 27.31±3.91△20.66±2.92*△17.69±2.84*△SOD（U/mL）94.37±18.36 47.60±10.54△58.33±14.16*△70.24±16.94**△

图1 各组心肌组织免疫组化图（400倍）

3 讨 论

心血管疾病是一种严重危害人类健康的疾病，虽然血运重建的方式对于挽救患者的心肌坏死和生命尤为重要，但再灌注本身能够导致缺血性心肌损害，心肌结构破坏和细胞死亡，从而诱发进一步的损伤，造成心功能的恶化。MI/R的机制复杂，炎性反应、钙超载、氧自由基等都在发病环节中起到了一定的作用，随着炎症性反应的出现，大量的氧自由基和细胞因子导致了血管通透性的增加和水肿。在本实验中，笔者通过观察丹参酮ⅡA预处理保护MI/R损伤，发现丹参酮ⅡA能减少炎性细胞因子的释放，增加SOD的合成，减轻氧自由基的释放，降低心肌梗死的面积，实现对心肌缺血再灌注的干预。

SOD作为机体内主要的抗氧化酶-超氧自由基清除剂，其活性代表了组织清除自由基的能力[9]。本研究中，与假手术组比较，模型组SOD显著减少，这是因为缺血再灌注中心肌的SOD合成减少、消耗增加，甚至部分被灌注液带走，说明本文制作的心肌MI/R模型成功。与模型组比较，两个丹参酮ⅡA组SOD活性均显著升高，说明高低剂量丹参酮ⅡA均能够增强缺血再灌注心肌中的SOD活性、减轻自由基的损伤，对MI/R起到明显的干预作用。

HMGB1主要在人体内的一些重要脏器以及组织广泛存在，比如心、肝、脾、肺、肾、脑等。除肝、脑组织中主要存在于细胞质外，在大多数组织中HMGB1存在于细胞核。表达HMGB1的基因位置为染色体13q12，通过相关的转录翻译过程最终产生[10-11]。HMGB1通常调控炎症反应的方式有：1）对于一般的细胞来说，部分出现凋亡的细胞会在被吞噬之前生成HMGB1，从而使自身消化，起到清除杂物的作用。2）在出现比较严重的炎症时，较多的巨噬细胞参与了炎症抵抗，吞噬细胞会产生较多的HMGB1，促进炎症的恶化，加重病情发展。在心肌缺血再灌注损伤模型中，HMBG1与其受体结合参与了心肌缺血再灌注损伤过程并发挥重要作用[12-16]。本研究中，丹参酮ⅡA能够明显降低HMGB1的表达，此外本研究显示丹参酮ⅡA干预还可以减少炎性因子IL-1β的表达并增加SOD的活性，保护了心肌缺血再灌注损伤，这些在高剂量组中效果更为明显。

总之，丹参酮ⅡA能够降低缺血梗死心肌组织中HMGB1及IL-1β的表达，增加SOD的活性，降低心肌梗死面积，在MI/R的进程中起到一定的保护作用。