电针不同穴位对肠易激综合征大鼠精神行为及NMDA受体表达的影响研究∗

覃 颖 王一凡 郭孟玮 蓝 莹 王 珊 吉毛先 朱文莲 任晓暄

（北京中医药大学，北京 100029）

肠易激综合征（IBS）是一种典型的身心性疾病，伴有腹痛、腹泻等腹部症状[1]。精神心理障碍是其重要病机之一[2]，与腹部症状通过脑-肠轴[3]相互影响，使“心”和“身”两方面的病症不断加重。因此，在治疗IBS时，应注重“心”即精神情绪方面的治疗，达到“心身”同调。

印堂与大椎穴均能调神，同属督脉，但二穴在功能上有所差异，印堂穴偏向于治疗不寐虚证、郁证等，而大椎穴偏向于治疗小儿惊风、癫狂痫证等。既往研究表明，NMDA受体与精神情绪等密切相关[4]。因此本实验以IBS模型大鼠为研究对象，通过比较电针“印堂”“大椎”二穴对IBS模型大鼠的腹部回撤反射检测（AWR）、旷场实验（OFT）以及实时荧光定量PCR检测前扣带回皮层（ACC）中NMDA受体的阳性表达，观察不同穴位对IBS情绪异常是否具有疗效及其效应差异，以此阐释经穴效应特异性。

1 材料与方法

1.1 实验动物 购入清洁级健康Wistar孕鼠5只，清洁柜饲养，室温维持在（23±2）℃，12 h昼夜交替，自由饮水。

1.2 试药与仪器 电子秤（ER-182A型，日本）；电针仪（LH-202H型，北京祯怡科技发展公司）；毫针（0.30 mm×13 mm，北京中研太和科技有限公司）；BL-420S生物机能实验系统（成都泰盟科技有限责任公司）；双腔儿科导尿管（BARD-FOLEY，美国）；乙酸、液体石蜡（北京化学试剂公司）；10%中性甲醛（北京百诺威生物科技有限公司）；2%戊巴比妥钠（北京欧北科技生物科技有限公司）；Tirzol试剂（美国Invitrogen公司），反转录酶、Taq酶、PCR试剂（Promega公司）；PCR引物由北京奥科生物技术有限公司合成。

1.3 造模与分组 孕鼠生产后，将幼鼠随机分为空白对照组、模型对照组、印堂组和大椎组，每组10只。除空白对照组外均造模，同等条件饲养。本实验方案符合实验动物伦理委员会伦理学规定。通过母婴分离加醋酸灌肠结合结直肠扩张（CRD）联合造模。方法如下：幼鼠出生2～21 d于8∶00～11∶00进行3 h的母婴分离。8～21 d给予0.5%醋酸灌肠，具体灌注量见表1。22～42 d不予任何干预。6周龄时给予CRD刺激（将润滑后的6F导尿管经大鼠肛门插入，深度约为7 cm，固定，待大鼠适应，用0.5 mL/min的速度均匀缓慢地向导尿管中注水0.5 mL扩张结直肠，维持30 s，以出现腹部抬起为准。重复3次，每次间隔5 min），加强模型的稳定性。造模至8周龄，普通喂养。

表1 IBS幼鼠模型制备醋酸灌注量（mL）

1.4 干预方法 两电针组在第9周进行电针治疗。穴位定位参照《实验针灸学》[5]：“印堂”（两眼中点偏上2 mm处，斜刺2 mm）；“大椎”（第7颈椎与第1胸椎间，直刺5 mm）。具体操作如下：固定大鼠，将针具刺入相应穴区，并在其旁开约1 mm的同一穴区再刺入1针，两针不相接触，以防短路。连接韩氏电针仪，同一对正负极连接同名穴区的两针柄，疏密波，2/100 Hz，强度以引起大鼠肢体微动为度，20 min/次，隔日1次，共5次。

1.5 检测指标 1）腹部回撤反射检测（AWR）：禁食不禁水8 h后进行AWR。本实验参照Al-Chaer[6]的方法予以改良，具体方法：自制球囊，将球囊、微量注射泵、压力换能器与BL-420S生物机能实验系统连接，并检查保证管路的密封性。固定大鼠：将大鼠放至与微量注射泵同高度的位置，固定并将润滑后的球囊头端缓慢插入肛门约8 cm，用胶布带与鼠尾固定。安抚大鼠等其适应后打开微量注射泵，以1 mL/min的速度匀速缓慢注水，共1.5 mL，使球囊扩张，持续时间为90 s。标记起始收缩波的潜伏期、收缩波个数。同一只大鼠检测3次（时间间隔30 min以上），取其平均值统计。2）旷场试验（OFT）：AWR测试后的第2天进行。适应实验环境约10 min后，打开自主行为装置，将大鼠放入敞箱中央，记录大鼠在5 min内水平和垂直运动（两个前肢同时竖立记为1次）的次数。每次测试后，清理敞箱，不留异物异味。3）实时荧光定量PCR检测NMDA receptor1（NR1）、NMDA receptor2A（NR2A）、NMDA receptor2B（NR2B）表达水平。麻醉处死大鼠，取脑组织，检测ACC中NMDA表达。NMDA receptor1：sense：5′-GCTGTACCTGCTGGACCGCT-3′，antisense：5′-GCAG TGTAGGAAGCCACTATGATC-3′，predicted size（bp）：219 bp；NMDA receptor2A：sense：5′-TCCATTCTTCTGTCATCC TGC-3′，antisense：5′-AAGACCGTCTCTCACTCTTGC-3′predicted size（bp）：225 bp；NMDA receptor2B：sense：TGCACAATTACTCCTCGACG-3′，antisense：5′-TCCGATTCTTCTTCTGAGCC-3′，predicted size（bp）：222 bp。

1.6 统计学处理 应用SAS8.2统计软件。计量资料以（）表示。组间差异采用单因素方差分析，继以LSD检验；不服从正态分布的数据用非参数检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠AWR实验结果比较 见表2。与空白对照组比较，模型对照组的潜伏期明显降低、收缩波个数明显增多（P＜0.01）；与模型对照组比较，印堂组的潜伏期明显上升、收缩波个数明显减少（P＜0.01），大椎组的潜伏期上升（P＜0.05）；与印堂组比较，大椎组收缩波个数明显增多（P＜0.01）。

表2 各组大鼠AWR实验结果比较（±s）

表2 各组大鼠AWR实验结果比较（±s）

与空白对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型对照组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与印堂组比较，◆◆P＜0.01。下同

n组别空白对照组模型对照组印堂组大椎组10 10 10 10潜伏期（s）82.83±6.45 51.02±11.07△△69.59±10.04△△▲▲62.25±10.47△△▲收缩波个数1.07±0.80 3.23±1.52△△1.33±0.50△△▲▲2.70±0.90△△◆◆

2.2 各组大鼠OFT结果比较 见表3。与空白对照组比较，模型对照组的水平以及垂直运动次数均明显减少（P＜0.01）；与模型对照组比较，印堂组水平以及垂直运动次数均明显增加（P＜0.01）；与印堂组比较，大椎组的水平运动次数明显减少（P＜0.01）。

表3 各组大鼠OFT结果比较（±s）

表3 各组大鼠OFT结果比较（±s）

组别空白对照组模型对照组印堂组大椎组n 10 10 10 10 5min水平运动次数1 575.10±255.36 1 050.70±271.56△△1 478.20±277.26▲▲1 126.90±214.48△△◆◆5min垂直运动次数151.50±36.03 81.20±36.64△△124.60±42.18▲▲103.20±23.42△△

2.3 各组大鼠NR1、NR2A、NR2B的表达比较 见表4。与空白对照组比较，模型对照组的NR1、NR2A、NR2B表达均增多（P＜0.05）；与模型对照组比较，印堂组的NR1、NR2A、NR2B表达均显著减少（P＜0.05），大椎组的NR1、NR2B表达均显著减少（P＜0.05），印堂组NR2A表达低于大椎组。

表4 各组大鼠NR1、NR2A、NR2B的表达比较（ΔΔCt，±s）

表4 各组大鼠NR1、NR2A、NR2B的表达比较（ΔΔCt，±s）

组别空白对照组模型对照组印堂组大椎组n 6 6 6 6 NR1 0.49±0.17 0.92±0.36△0.59±0.14▲0.53±0.37▲NR2A 0.40±0.14 0.73±0.19△0.40±0.27▲0.54±0.33 NR2B 0.49±0.17 0.92±0.36△0.59±0.14▲0.53±0.37▲

3 讨 论

NMDA受体[7]（NMDAR）是一种配体门控离子型谷氨酸受体，参与中枢神经系统许多重要的生理病理过程，是治疗某些神经精神性疾病的靶点。NR1是NMDA受体复合物的必需功能亚单位，NR2是NMDA受体活性的调节亚单位，因此高活性的NMDA受体通道必须由一个NR1以及一个或几个NR2亚型共同构成异寡聚体所形成[8]。NR2A和NR2B大量分布于与疼痛传导密切相关的ACC中[9]，因此ACC中NMDA受体的激活（尤其是NR2A和NR2B）对疼痛情绪的产生发挥了重要的作用[10]。黄俊景[11]发现 ACC 内的NR2A和NR2B在炎症后表达上调，增强了ACC神经元的兴奋性，这可能是导致疼痛情绪形成的重要原因。本实验中，IBS模型大鼠NMDA受体在ACC中的表达增高，与以往实验结果一致。

针灸对于情绪方面的疾病有独有的优势。督脉“上入络脑”，治疗上常取督脉的穴位用以调神。印堂穴为经外奇穴，为两边目系交汇，与多条阴经联系，如足厥阴肝经、手少阴心经等，心、肝二阴经在治疗情志病中有着重要作用。笔者认为印堂穴所灌注的气血中，更多的是肝、心等阴经的气血，这也是古人历经千年并没有将其列为督脉穴位的原因。临床研究[12-13]发现印堂穴能有效改善焦虑抑郁等精神异常类的慢性疾病，且对提高IBS的排便满意度效果良好。大椎穴是手足三阳与督脉的交会穴，其六阳之气充盛，针刺大椎可加强元神之府对全身脏腑机能的调整作用，有除阳经邪热、定志安神之功。临床研究[14-15]发现大椎穴多用来治疗热扰神明所致的失眠、中风后抑郁、癫痫等急性精神类疾病，治疗单纯性抑郁症的研究少见。

中医认为，肝郁脾虚[16]是IBS主要发病因素。从其病机来看，印堂穴对IBS情绪方面的疗效应优于大椎。本实验造模周期长，与IBS的发病特征一致，大鼠出现精神淡漠等抑郁样情绪。实验结果表明电针“印堂”“大椎”穴后均能调节IBS大鼠抑郁样精神行为，且印堂组优于大椎组，与中医理论基本相符。

综上所述，“印堂”和“大椎”穴均可改善IBS模型大鼠的抑郁样行为，但两者存在效应差异，即“印堂”穴的作用明显优于“大椎”穴。说明相同经脉且有相近主治功能的穴位亦具有经穴效应特异性。在本实验中，“印堂”和“大椎”穴也可缓解腹痛，降低肠道高敏感性，这也体现了中医的整体观，但二穴之间差异的确切机制尚有待进一步深入研究。