强心一号复方对脓毒症小鼠心肌细胞凋亡的影响∗

王雪蕊 徐霄龙 黄 坡 哈雁翔 张 瑞 郭玉红 刘清泉 △

（1.首都医科大学附属北京中医医院，北京 100010；2.中医感染性疾病基础研究北京市重点实验室，北京 100010；3.北京市中医研究所，北京 100010）

脓毒症是指宿主应对微生物感染的应答反应失调进而导致的危及生命的多器官功能障碍[1]。脓毒症是重症监护病房（ICU）内死亡的主要原因，约占ICU死亡率的10%～50%[2]。脓毒症心功能不全是脓毒症的严重并发症，其发生率为40%～50%，病死率高达70%～90%，与未合并心功能障碍的脓毒症患者相比，此类患者病死率增加20%[3]。脓毒症心功能不全属于可逆性的心脏损伤，因此早期对其进行干预治疗对于降低脓毒症的病死率具有重要的意义[4]。课题组根据多年临床经验，总结出益气温阳、活血利水的中药复方强心一号，发现其对于脓毒症患者心脏功能具有改善作用。前期基础研究也证实，该复方显著降低盲肠结扎打孔（CLP）脓毒症小鼠的死亡率，并显著改善其射血分数和缩短分数等心功能指标[5]。本研究旨从心肌细胞凋亡和心脏凋亡相关蛋白调节的角度，探讨强心一号复方对脓毒症小鼠的心脏保护机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用C57BL/6J北京小鼠，雄性，10周龄，体质量20～23 g，均为SPF级饲养，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2014-0004，使用许可证号：SCXK（京）2015-0023，由北京中医医院中医研究所按纯系动物要求专人饲养。各组小鼠自由进水进食，保持室温恒定，实验方案通过北京市中医研究所动物伦理委员会认可，实验过程中对动物的处置符合有关善待实验动物的规定。

1.2 实验药物 参照《中华人民共和国药典》，所有药物由首都医科大学附属北京中医医院中药房提供。强心一号复方组成：水红花籽30 g，黄芪30 g，茯苓20 g，丹参20 g，五味子10 g。按原方比例，110 g药材加水400 mL浸泡30 min，沸腾后煎煮30 min，浓缩至110 mL，以质量浓度1 g/mL作为实验用药剂量，并放于冰箱4℃冷藏备用。

1.3 仪器和试剂 光学显微镜（BX51型，日本Olympus），台式离心机（Allegra X-30R 型，美国 BECKMAN），酶标仪（ELx808型，美国Biotek），Odyssey双色红外激光成像系统（Odyssey CLX，美国Odyssey）。WGA 工作液（批号L4895，美国Sigma），TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（ab206386，美国abcam），BCA蛋白测定试剂盒（23225，美国Thermo），蛋白酶抑制剂（78429，美国Thermo），戊巴比妥钠（批号57-33-0，上海榕柏生物技术有限公司），抗B细胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）抗体（ab182858，美国abcam），抗Bcl-2相关 X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗体（ab32503，美国abcam），抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase3）抗体（ab13847，美国abcam），抗裂解的caspase3（Cleaved caspase3）抗体（ab2302，美国abcam），抗GAPDH抗体（TA309157，北京中杉金桥）。

1.4 分组与造模 采取随机数字表法将动物分为对照组、模型组、强心组，每组12只。模型组、强心组小鼠进行CLP造模。模型制备方法：1%戊巴比妥钠腹腔麻醉小鼠，固定，消毒，于腹中线开口，轻柔取出盲肠，结扎1/2长度盲肠，使用5 mL注射器针头于结扎段贯穿盲肠1次。对照组小鼠麻醉后进行假手术操作，不进行结扎和穿刺。术毕小鼠背部皮下注射生理盐水2 mL防治休克。

1.5 干预方法 强心组于造模后2 h给予1 g/kg强心一号复方灌胃，灌胃体积1 mL。模型组与假手术组于造模术后2 h给予1 mL生理盐水灌胃。各组均每日干预1次，持续48 h。

1.6 标本采集与检测 1）脓毒症小鼠临床评分。CLP术后6 h及24 h，根据SHIRPA协议[6-7]，基于以下参数对脓毒症小鼠进行临床评分测定。每一项参数如有变化得1分，最多12分。观察参数包括腹部扭动，立毛，粪便变化（如腹泻），流泪，睑闭合，运动活性低，体温低（低于35℃计1分），反射性逃避触摸，自发活动变化，握力降低和呼吸频率变化（换气过度）。2）心脏组织病理切片制备及染色。各组小鼠CLP术后48 h进行麻醉，用含有肝素的0.9%氯化钠注射液灌注心脏，剪下心脏组织，4%多聚甲醛中固定过夜，然后进行常规脱水包埋制作石蜡切片。3）采用WGA染色检测心肌细胞面积。切片经二甲苯和梯度乙醇脱蜡至水，柠檬酸抗原修复90 s，PBS缓冲液洗3遍，用血清封闭液室温封闭30 min，WGA工作液10 μg/mL 37℃孵育60 min，PBS缓冲液洗3遍，DAPI封片。使用Nikon ECLIPSE 90i显微镜进行病理图像采集，使用NIS Br 4.0软件对心肌细胞面积进行数据分析。4）心脏组织TUNEL细胞凋亡测定。根据试剂盒说明书，将石蜡切片脱蜡至水。由20 μg/mL蛋白酶K溶液通透，室温孵育8～10 min，PBS泡洗。3%过氧化氢溶液室温孵育20 min后PBS泡洗。制备rTdT孵育缓冲液并进行室温孵育60 min后终止反应。配制Streptavidin-HRP工作液和DAB显色液进行显色，可见TUNEL染色阳性（棕色）的凋亡细胞。采用Nikon ECLIPSE 90i显微镜进行切片观察，NIS Br 4.0软件对阳性细胞百分比进行统计。5）Western blotting法检测。各组小鼠取心脏组织匀浆后，使用蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA法检测总蛋白的浓度。配制凝胶，进行SDS-PAGE电泳，电转，血清封闭等步骤。加入Bcl-2抗体、Bax抗体、Caspase3抗体、Cleaved caspase3抗体、GAPDH一抗（1∶1 000）孵育，4℃过夜。第2天室温平衡，TBST洗涤后加入对应荧光二抗孵育。采用Odyssey双色红外激光成像系统对硝酸纤维膜上的蛋白进行量化测定，Bcl-2和Bax以GAPDH作为参比蛋白，Cleaved caspase3以Caspase3作为参比蛋白，Image J对灰度进行分析统计。

1.7 统计学处理 所有数据以（）表示，组间比较采用单因素方差分析，并用Turkey法（方差齐时）或Dunnett′s T3（方差不齐时）作组间多重比较。当检验变量不服从正态分布时，采用非参数统计中的Kruskal-Wallis检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠临床评分比较 见表1。与对照组相比，模型组6 h和24 h的临床评分值均显著升高（P＜0.05）。与模型组相比，强心组的临床评分在24 h显著下调（P＜0.05），6 h时无显著差异。提示强心一号复方对CLP术后小鼠的大体状态具有一定改善作用。

表1 各组小鼠临床评分比较（分，±s）

表1 各组小鼠临床评分比较（分，±s）

与对照组比较，∗P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。下同

组别对照组模型组强心组24 h 0.0±0.2 7.0±1.2*5.0±1.5#6 h 0.0±0.5 6.0±3.0*5.0±3.0

2.2 各组小鼠心肌细胞结构比较 见图1，表2。结果发现对照组心肌细胞排列规律，大小一致。与对照组相比，模型组小鼠心肌细胞面积显著增大（P＜0.05），排列不规律。与模型组相比，强心组心肌细胞面积显著下降（P＜0.05）。说明强心一号复方对脓毒症小鼠心肌细胞代偿性肥大具有一定改善作用。

图1 各组小鼠心肌细胞结构（WGA染色，400倍）

表2 各组小鼠心肌细胞面积比较（μm2，±s）

表2 各组小鼠心肌细胞面积比较（μm2，±s）

项目心肌细胞面积对照组263.74±9.47模型组429.23±10.65*强心组298.53±16.72#

2.2 各组小鼠心肌细胞凋亡比较 见图2，表3。采用TUNEL染色评价CLP术后48 h对照组、模型组、强心组小鼠心脏组织凋亡情况，并统计各组TUNEL阳性细胞的百分比。结果发现对照组心脏组织几乎没有凋亡细胞。与对照组相比，模型组小鼠心肌细胞凋亡显著增多（P＜0.05）。与模型组相比，强心组心肌细胞凋亡显著减少（P＜0.05）。说明强心一号复方对脓毒症术后小鼠心脏组织的凋亡具有改善作用。

图2 各组小鼠心脏组织凋亡情况（TUNEL染色，100倍）

表3 各组小鼠心脏TUNEL阳性细胞数比较（%，±s）

表3 各组小鼠心脏TUNEL阳性细胞数比较（%，±s）

项目心脏TUNEL阳性细胞对照组0.268±0.098模型组4.387±0.676*强心组0.960±0.327#

2.3 各组小鼠心脏组织凋亡相关蛋白表达的比较 见表4。与对照组相比，模型组小鼠心脏组织促凋亡蛋白Cleaved Caspase3的蛋白表达显著上调（P＜0.05），Bcl-2和Bax蛋白表达变化无显著性差异。与模型组相比，强心组心脏组织中Bcl-2蛋白表达显著上调（P＜0.05），Bax和Cleaved Caspase3蛋白表达显著下调（P＜0.05）。提示强心一号复方对CLP术后心脏组织凋亡相关蛋白的表达具有调节作用。

表4 各组小鼠心脏组织凋亡相关蛋白表达的比较（±s）

表4 各组小鼠心脏组织凋亡相关蛋白表达的比较（±s）

组别Bcl-2/GAPDH Bax/GAPDH Cleaved Caspase3/Caspase3对照组模型组强心组1.044±0.024 0.883±0.080 1.990±0.206#1.024±0.036 1.082±0.078 0.426±0.042#1.030±0.035 2.072±0.112*0.624±0.127#

3 讨 论

脓毒症心功能障碍可归属于中医学“心水”“喘证”“水肿”等范畴[8]。此类患者心气阳虚，兼具水饮及血瘀等邪实互扰，多为本虚标实、虚实夹杂证，病位涉及肺、脾、肝、肾诸脏的功能失调，治宜益气温阳、活血利水。强心一号配方是本团队根据本院国家级名老中医黄丽娟教授多年中西医结合防治心血管病的临床观察，在结合古代文献及中医经典理论的指导下形成的有效方剂。方中黄芪补气升阳、益卫固表、利水消肿，补而不滞，为君药；茯苓、丹参、水红花籽可健脾、利水、渗湿、活血，为臣药；五味子养阴收敛，可收敛心气，防止益气温阳药辛温伤阴散气，为佐使药。前期基础实验证实该方能显著降低脓毒症小鼠死亡率，对心脏射血分数和缩短分数等心功能指标也有显著的改善作用[5]。本研究根据SHIRPA协议对CLP术后小鼠进行临床评分测定，结果发现与模型组相比，强心一号对CLP术后24 h小鼠的临床评分具有显著的改善作用，进一步证明了该复方对于脓毒症小鼠的疗效。

脓毒症患者出现的心功能障碍属于可逆性的，患者早期出现血流动力学变化，心室收缩、舒张能力轻微改变，随着病情的发展，到后期出现心输出力和容量反应性下降、心肌收缩能力下降、射血功能减退等，并可见以左心室为主的心室扩张重构[3，9-10]。由于心肌收缩力的改变，心肌细胞会出现代偿性的心肌肥大，从而维持心功能。本研究发现CLP术后心肌细胞出现代偿性肥大，与模型组相比强心一号复方可显著降低心肌细胞面积，说明该复方对于CLP术后心脏重构具有一定改善作用。

细胞凋亡是脓毒症发生器官功能损伤的主要病理机制之一[11-12]，脓毒症发生时心肌细胞内凋亡相关信号通路激活，包括由Caspase-9激活介导的内源性细胞凋亡途径、Caspase-8激活介导的外源性细胞凋亡途径以及内质网应激等激活的凋亡相关途径[13-14]。Caspase-3是细胞凋亡的执行者，是外源性凋亡途径、线粒体凋亡途径、内质网凋亡途径的交汇点[15]。其活化形式是Cleaved Caspase-3，可通过识别和切割抗凋亡蛋白氨基酸序列、水解DNA核酸内切酶抑制因子，增强DNA内切酶的活性从而促进细胞凋亡的发生[16]。Bcl-2家族主要包括抗凋亡基因（如Bcl-2、Bcl-xl等）和促凋亡基因（如Bax、Bid等），主要激活线粒体凋亡途径[17]。其中Bcl-2和Bax和作为Bcl-2基因家族的代表成员，通过影响线粒体跨膜电位的稳定性和线粒体通透性转换孔的开放，介导凋亡的发生[18]。本研究发现，与对照组相比模型组心脏组织TUNEL阳性细胞数量显著增加，Cleaved Caspase3表达显著上调，说明脓毒症可促进心肌细胞凋亡的发生。强心一号复方可显著下调心脏组织TUNEL阳性细胞的数量，上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，同时下调Bax和Cleaved Caspase3的表达，说明强心一号复方对脓毒症的心脏保护作用可能与调节心肌细胞凋亡和心脏凋亡相关蛋白的表达有关。

综上所述，本研究发现强心一号复方可显著改善CLP小鼠术后的临床评分，改善心肌代偿性肥大和凋亡情况，其机制可能与上调Bcl-2、下调Bax和Cleaved Caspase3蛋白表达有关。