血清长链非编码RNA DANCR在非小细胞肺癌诊断中的临床应用

周建英 刘震天 侯 洪 胡珍珍 刘晖群 肖 丹

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占所有肺癌患者的80%～85%左右，由于目前对于NSCLC缺少有效的筛查手段，多数患者确诊时已处于晚期，失去了手术治疗机会[1]。近年来，长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在肿瘤发生及发展方面的研究受到广泛关注[2]。LncRNA是一类长度大于200个核苷酸、缺少完整的开放阅读框、无蛋白质编码功能的RNA分子[3]。近期研究证实，lncRNA可稳定存在于机体的各种体液中，包括血清、尿液、唾液等[4-5]，使得lncRNA作为疾病早期诊断和预后评估的分子标志物成为可能。分化拮抗非蛋白编码RNA(DANCR，differentiation antagonizing non-coding RNA)是2012年由Kretz等发现并定义的1个lncRNA，定位于人体4号染色体，全长915个碱基[6]。近年研究发现，DANCR在多种肿瘤中高表达，参与了肿瘤发生和发展过程的调控[7]。有文献报道在NSCLC肿瘤组织中DANCR表达显著升高，参与肿瘤的发生发展[8-9]，但DANCR在NSCLC患者血清中是否表达，表达水平与NSCLC临床病理特征是否相关尚未见报道。本研究采用实时荧光定量PCR技术(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)检测NSCLC患者血清中DANCR的表达情况，并同时分析其与NSCLC患者各临床病理参数之间的关系，初步探讨血清DANCR在NSCLC临床诊断中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 一般资料

NSCLC组：收集2017年1月至2018年8月于江西省肿瘤医院住院的初诊NSCLC患者82例，其中男性50例，女性32例；年龄42～79岁，中位年龄68岁，均经病理学或细胞学检查确诊。其中腺癌57例，鳞癌25例；根据国际抗癌联盟(UICC，2009年第7版)TNM分期Ⅰ期21例，Ⅱ期31例，Ⅲ期12例，Ⅳ期18例。肺良性疾病组：收集同期就诊的肺部良性疾病患者45例作为肺良性疾病组，年龄36～74岁，中位年龄63岁，其中肺炎23例，慢性支气管炎15例，慢性阻塞性肺疾病7例，所有患者经胸腹部CT等检查未发现肺癌及其他部位肿瘤证据。健康对照组：收集同期门诊健康体检者血清50例，其中男性32例，女性18例；年龄35～72岁，中位年龄58岁。本研究经江西省肿瘤医院医学伦理学委员会批准，患者知情同意。7600型定量 PCR仪购自美国ABI公司；Trizol LS试剂购自美国Invitrogen公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser和SYBR®Premix Ex TaqTM均购自大连宝生物TaKaRa公司。

1.2 标本收集与处理

分别采集NSCLC患者术前、肺部良性疾病患者及健康体检者空腹静脉血2 ml，置于促凝管中，轻轻混匀后，室温放置30 min，采用两步离心法获取血清，1500 r/min离心10 min，吸取上清，然后将上清12000 r/min离心2 min，分离血清置于无RNA酶EP管中，血清样本于-80 ℃保存。

1.3 RT-qPCR检测

吸取250 μl血清，分别加入Trizol LS试剂，混匀后按Trizol LS试剂说明书提取总RNA，用无RNA酶双蒸水溶解后，采用紫外分光光度计测定总RNA浓度和质量。采用反转录成互补脱氧核糖核酸。反转录反应按TaKaRa公司PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒说明书操作，选择β-actin作为内参。采用SYBR法进行RT-qPCR检测，检测步骤及反应条件参照试剂盒说明书进行。引物由本实验室设计，由上海生工生物工程有限公司合成：DANCR上游引物为：5'-TCGGAGGTGGATTCTGTT-3'，下游引物为5'-TTCGGTGTAGCAAGTCTG-3'；内参β-actin上游引物为5'-CCTGGCACCCAGCACAAT-3'，下游引物为5'-GGGCCGGACTCGTCATAC-3'。反应体系为20 μl，即：1×SYBR Green I master-mix、0.5 μmol/l特异前向引物、0.5 μmol/l特异反向引物、1 μl反转录产物。反应条件为:预变性95 ℃ 10 min后，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，40循环。RT-qPCR使用Applied Biosystems 7600仪器进行。所有样品做3复孔。根据待测标本的Ct值，以β-actin为内参照，采用相对定量法对RT-qPCR结果进行分析，以2-△△Ct计算。△Ct=目的基因Ct-内参基因Ct，△△Ct=待测标本△Ct-对照样本△Ct。

1.4 统计学方法

对实验数据应用SPSS 17.0统计软件进行分析。各组lncRNA数据经正态分布及方差齐性检验，呈偏态分布，用中位数和四分位数间距[M(Q1,Q3)]表示，两组间比较用Mann-Whitney U检验，多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验，P<0.05为差异有统计学意义。受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线及曲线下面积(area under the ROC curve，AUC)来评估血清DANCR诊断NSCLC的效能参数。

2 结果

2.1 各组血清DANCR的表达水平

采用RT-qPCR法检测82例NSCLC患者、45例肺良性疾病患者及50例健康体检者血清中DANCR的表达差异，结果显示，NSCLC组血清中DANCR表达水平为3.05(1.94，4.29)，显著高于肺良性疾病组[1.33(0.96，2.48)]及健康对照组[1.01(0.81，1.50)]，差异有统计学意义(P<0.001)(图1A)。肺良性疾病组与健康对照组血清中DANCR表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。此外，肺部良性疾病组中肺炎患者、慢性支气管炎患者及慢性阻塞性肺疾病患者血清DANCR水平差异无统计学意义(P>0.05)(图1B)。

2.2 NSCLC患者血清DANCR表达水平与临床病理特征的关系

分析发现，NSCLC患者血清DANCR的表达水平与患者的性别、年龄、是否吸烟、病理类型、分化程度及是否有淋巴结转移无明显关系(P>0.05)，而与肿瘤大小及临床分期有关(P<0.05)(表1和图2)。

A为NSCLC组、肺良性疾病组及健康对照组血清DANCR水平；B为肺良性疾病组中肺炎患者、慢性支气管炎患者及慢性阻塞性肺疾病患者血清DANCR水平。图1 不同分组中血清DANCR表达水平的散点图

表1 NSCLC患者血清DANCR表达水平与临床病理特征的关系

2.3 血清DANCR作为NSCLC诊断效果的评估

利用ROC曲线分析血清DANCR对NSCLC诊断效能，分析结果显示，单项检测时，DANCR、CEA和Cyfra21-1的AUC分别为0.830、0.760和0.736。DANCR的敏感度和特异度均为最高，分别为75.61%和84.00%。双项联合检测时，DANCR与CEA联合的敏感度最高(85.37%)，DANCR与Cyfra21-1联合的特异度最高(90.00%)。当联合检测DANCR、CEA和Cyfra21-1三项指标时，其AUC可达0.923，敏感度为89.02%，特异度为84.00%。结果见图3和表2。

3 讨论

LncRNA是近年来肿瘤学领域关注的焦点，参与了肿瘤的生长、转移及预后等多个环节。目前越来越多的证据表明，lncRNA在NSCLC的发生、发展中均扮演着极其重要的角色。已有的研究证实，DANCR上调表达与恶性肿瘤的发生发展有着密切关系[10]。如，Guo等[11]研究发现DANCR在肝癌组织中表达显著升高，且与临床分期及患者预后显著相关，机制研究发现DANCR可作为miRNA海绵吸附miR-27a-3p，调控下游ROCK1/LIMK1/COFILIN1信号通路促进肝癌发生发展。Wang等[12]报道DANCR可通过结合EZH2调节FBP1基因启动子组蛋白甲基化，从而调节胆管癌细胞的生长和迁移。对于肺癌中DANCR表达的研究见于组织学和细胞系。Guo等[13]研究证实，DANCR在NSCLC癌组织中表达显著升高，DANCR可通过抑制p21基因表达，促进NSCLC的发生发展。另有研究表明，DANCR能够吸附miR-496，进而调控其靶基因mTOR表达促进NSCLC进展[14]。目前，尚未见有关NSCLC患者血清中DANCR报道。

本研究采用RT-qPCR技术检测了82例NSCLC患者、45例肺良性疾病患者及50例健康对照者血清中DANCR的表达差异，结果表明，DANCR在NSCLC患者血清中表达显著升高。在分析NSCLC患者血清DANCR表达水平与临床病理特征的关系显示，DANCR的表达水平与TNM分期及肿瘤大小显著相关，而与其他临床病理特征无关，提示NSCLC患者血清DANCR可作为评估临床分期及肿瘤大小的潜在指标。

A为肿瘤大小分组；B为TNM分期分组。图2 NSCLC患者不同分组中血清DANCR表达水平的散点图

A为单独指标；B为联合指标。图3 NSCLC患者DANCR、CEA和Cyfra21-1单独及联合的ROC曲线

表2 DANCR、CEA和Cyfra21-1单独或联合检验效能

发掘具有更具特异、敏感的生物学诊断标志物是NSCLC研究的热点之一。本研究采用ROC曲线及AUC来评价血清DANCR对NSCLC的诊断价值，结果显示血清DANCR(AUC为0.830)比传统指标CEA(AUC为0.760)和Cyfra21-1(AUC为0.736)有更好的诊断效能，对NSCLC的辅助诊断有一定帮助。相对于单个肿瘤标志物检测，综合多种生物学标志物检测或可提高肿瘤诊断的敏感性及准确性。本研究结果显示，DANCR与CEA联合检测可显著提高敏感度(85.37%)，DANCR与Cyfra21-1联合检测则可显著提高特异度(90.00%)。当三项指标联合检测时，其AUC最大，为0.923，敏感度最高为89.02%。因此，血清DANCR与CEA、Cyfra21-1联合，提高其对NSCLC诊断的诊断效能和敏感度。

综上所述，NSCLC患者血清中DANCR表达明显升高，血清DANCR与传统肿瘤标志物联合检测可获得较好的诊断效能，或可为NSCLC的辅助诊断提供新的靶点。