miR-27a对不同病变程度宫颈组织Siha细胞增殖的影响

张 毅 范 丽 马亚琳 李著艳 刘 莹 王任晓

宫颈癌是恶性肿瘤之一，其主要发病原因为hr-HPV感染导致宫颈组织逐渐恶化并形成淋巴结转移[1]。宫颈组织恶化发生原因有多种，宫颈肿瘤微环境变化是反映宫颈组织恶化的1种标志，微环境中如浸润大量炎症细胞，将导致肿瘤相关性炎症，进而恶性发展成为癌症，而癌症发生、进展和预后不良与肿瘤相关巨噬细胞有着密闭可分的关系[2-3]。微型蛋白质是1种单链且有编码蛋白功能的小分子蛋白质，它具有调控基因的表达、抑制或活化靶基因的功能，也对基因转录或转录后的水平均具有调控作用[4]。有研究发现，微型蛋白质中miR-27a在很多癌症中起着重要的促癌症作用[5]。本文通过回顾性分析在本院治疗的宫颈癌患者相关资料，研究分析miR-27a在宫颈组织不同病变程度时的表达水平分析，为宫颈癌患者的治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 基本资料

选取2015年1月至2018年1月在本院治疗的宫颈组织病变患者120例，以确诊为仅HPV-16阳性感染的正常宫颈组织患者为对照组(n=40)，以确诊为HPV-16阳性宫颈癌前病变组织和HP-V16阳性早期宫颈鳞癌患者的病变组织为研究组1(n=40)、研究组2(n=40)。三组患者基本资料对比差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，详见表1。本研究经本院伦理委员会批准，患者或家属知情并同意。

表1 三组患者基本资料对比

1.2 纳入及排除标准

纳入标准：确诊为hr-HPV感染患者；无其他重大器官疾病患者；无精神疾病，能独立完成调研患者；患者临床资料齐全。

排除标准：孕妇与急性盆腔感染患者；接受过放射治疗与化疗等非手术治疗患者；宫颈腺癌患者。

1.3 方法

宫颈癌细胞培养：调适培养箱，使其温度为37 ℃，湿度95%，二氧化碳浓度为5%，在箱内培养接种Siha。每天观察细胞生长状况1～2次，并据需换液。采用显微镜进行观察细胞生长状况，至细胞处于对数生长期，对细胞进行冻存、传代等处理。在细胞覆盖率达90%以上时，对所需的细胞内DNA或者RNA进行提取，留作实验使用。

细胞转染：转染片段序列的设计与合成均由上海吉玛生物技术有限公司完成。miR-27a模拟物(miR-27amimic)、miR-27a模拟物对照(miR-27amimic NC)、miR-27a抑制物(miR-27a inhibitor)、miR-27a抑制物对照(miR-27a inhibitorNC)。转染具体步骤如下：①以1 000 r/min的转速对胰酶消化处理后的宫颈癌细胞离心5 min；②将2 ml DMEM培养基重悬细胞加入离心管中，随后以每孔100 μl培养液标准将该细胞放置于96孔板中培养，共设立5组，每组均含有复孔3个，置于培养箱中培养。③细胞生长状态采用显微镜观察，待细胞贴壁之后，吸除培养基，并用PBS清洗细胞2次。④按照说明书对inhibitor组的小孔中加入10 μl的Lipofectamine3000与miR-27amimic混合物，用剂量Lipofectamine3000与miR-27ainhibitorNC的混合物加入miR-27a抑制对照组；并采用相同的方法对mimic组及空白对照组处理，后放入培养箱中孵育6小时。

1.4 指标检测

1.4.1 细胞转染率检测 将进行过荧光标记的miRNA转染Siha内，后加入无血清培养基，于培养箱内进行6 h培养。加入转染试剂，待混合充分放置于培养箱内培养24 h，后采用PBS在避光下清洗细胞3次。使用200倍光镜及荧光显微镜观察细胞形态并计数荧光亮点。阳性细胞为由绿色荧光蛋白显示的细胞，以此计算细胞的转染效率。

1.4.2 miR-27a表达检测 采用试剂盒法提取血清总RNA，以反转录后的cDNA为模板，采用RT-PCR检测miR-27a相对表达量。

1.4.3 细胞增殖检测 细胞接种：在96孔板中接种对数生长期的Siha细胞，实验共5组，每组8 000个细胞，复孔3个，分别对每孔加入200 μl培养基，置于培养箱内；将miR-27a模拟物(miR-27amimic)、miR-27a模拟物对照、miR-27a抑制物、miR-27a抑制物对照及Lipofectamine3000加入各实验组及其复孔，进行转染；分别在细胞转染后、转染48 h及72 h，对96孔板中细胞活性进行检测，后重新加入新鲜培养基及10 μl的CCK-8试剂，缓慢均匀摇匀，放入培养箱中孵育2 h。采用酶标仪测定每小孔的吸光度，作为细胞增殖测定。

1.4.4 细胞凋亡检测 使用6孔板接种处于对数生长期时的Siha细胞并进行细胞转染。转染72 h后，将细胞原培养基移至离心管中洗涤一次。将胰酶加入96孔板中进行消化后收集细胞，最后1 000 rmp，室温，离心，10 min。带上述操作结束，收集并使用结合缓冲液重悬细胞，稀释、计数细胞约1×106个细胞/ml。

在避光条件下将100 μl上述细胞悬液加入5 μl的工作液中孵育，后加入400 μl结合缓冲液进行混合，均匀后进行分析检测。

1.4.5 SIPA1L3的表达水平检测 将蛋白样品加入上样缓冲液中，混匀后进行分钟沸水加热；参照试剂盒使用说明书进行分离胶与浓缩胶配置；将上述凝胶放入电泳槽后，依次加入缓冲液、Marker及待测的样品蛋白；将上述样品进行30 min的90 v恒压存放，后进行60 min的150 v恒压电泳，待溴酚蓝进入分离胶边缘的界面电泳停止。取出并切除多凝胶余部分，放置缓冲液中浸泡；以凝胶的大小为标准裁剪PVDF膜，并置于甲醇中激活，后将PVDF膜与滤纸均放入电转缓冲液中，除去气泡后，100 mA电流进行转膜；封闭：配置封闭液，并放置PVDF膜，后进行3 h的温室轻摇封闭；孵育一抗：稀释一抗，并放入封闭后的PVDF膜，4 ℃恒温存放一夜；洗膜：用TBST溶液洗涤PVDF膜3次，10 min/次，去除一抗；孵育二抗：稀释并加入二抗，放入PVDF膜，后进行1 h室温孵育；洗膜：同上述洗膜步骤；避光配置ECL发光液，并滴加在PVDF膜上，进行3 min孵育。曝光并拍摄条带；分析比较：相对表达量=灰度值/内参的灰度值。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 miR-27在不同程度宫颈病变组织中的表达

采用荧光定量PCR检测miR-27在三组患者中的表达可知。研究组1、2中miR-27a表达显著高于对照组，且研究组2中miR-27a表达量高于研究组1，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 不同程度宫颈病变组织中miR-27表达量对比

注：a表示与对照组相比，P<0.05；b表示与研究组1相比，P<0.05。

2.2 细胞转染率检测

采用荧光检验法对细胞的转染情况进行检测可知，Siha细胞中FAM荧光标记的阳性细胞形态正常、凋亡及漂浮较少等，转染效果明显。

2.3 miR-27a表达量测定

对比转染mir-27a模拟组、抑制组与mir-27a对照组中mir-27a的表达量可知，模拟组mir-27a表达量显著高于mir-27a对照组，抑制组mir-27a表达量显著低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，但模拟、抑制对照组中mir-27a表达量与空白对照组对比，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 转染后的宫颈组织细胞中miR-27a表达量测定

注：a为与miR-27a模拟对照组相比，P<0.05；b为与miR-27a抑制对照组相比，P<0.05。

2.4 细胞增殖状况

采用CCK-8法检测模拟组、模拟对照组、抑制组、抑制对照组及空白对照组转染Siha细胞后及转染48、72 h的细胞增殖水平，重复测量方差分析结果显示：组间转染试剂与组内增殖时间交互影响，且对细胞增殖起到显著的影响作用(P<0.05)，多重比较可知，与miR-27amimic组Shia细胞增殖能力显著高于miR-27amimic NC组，miR-27a inhibitor组则弱于miR-27a inhibitor NC组，差异均有统计学意义，见表4。

表4 miR-27a对Siha细胞增殖的影响

注：a为与miR-27a模拟对照组相比，P<0.05；b为与miR-27a抑制对照组相比，P<0.05。

2.5 细胞凋亡状况

转染72 h后，模拟组细胞凋亡率显著低于miR-27a模拟对照组，抑制组凋亡率显著高于miR-27a抑制对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表5。

表5 miR-27a对siha细胞凋亡的影响

注：a为与miR-27a模拟对照组相比，P<0.05；b为与miR-27a抑制对照组相比，P<0.05。

2.6 miR-27a对SIPA1L3蛋白表达的调控

转染72 h后，对比SIPA1L3蛋白的表达量可知，miR-27a模拟组显著低于miR-27模拟对照组，miR-27a抑制组显著高于miR-27a抑制对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图1。

图1 转染72 h后Siha细胞中SIPA1L3相对表达水平

3 讨论

miRNAs的异常表达与多种癌症的发生、发展及预后等密切相关[6-7]。宫颈癌的发生有多种miRNA参与，它们在宫颈癌组织中活跃表达，且在不同病变程度的宫颈组织中表达量差异较为[8-9]。而miR-27a是1种致癌miRNA，主要由P53、E2F和c-Myc调制而成，它具有一定的原癌基因活性[10]。

有研究表明，miR-27a在多种肿瘤的生物学过程中均能活跃表达，具有一定的促癌作用[11-12]。本研究发现，miR-27a在三组患者中的表达量完全不同，且随着宫颈组织的恶化，miR-27a的表达量逐渐升高，可知，宫颈组织的病变与miR-27a的表达密切相关。本文同时对细胞功能与miR-27a表达的关系进行相关研究，探究对miR-27a对Siha细胞的生物学行为影响，结果表明：miR-27a高表达时，Siha细胞的增值能力显著增强，凋亡现象发生较少。而miR-27a低表达时，Siha细胞的增殖能力也受到了抑制，增殖较为缓慢，但Siha细胞的凋亡速度反而显著增快。由此可知，宫颈组织病变过程中，miR-27a的表达能够促进癌症发生，同时说明miR-27a具有原癌基因活性[13-14]。有研究表明通过抑制miR-27a的表达，能够增加蛋白的表达，因此可知，miR-27a在不同肿瘤中发挥作用[15-16]。本研究通过对宫颈癌细胞进行转染，促使Siha细胞内miR-27a高表达或低表达，并采用蛋白印迹法对Siha细胞中SIPA1L3蛋白表达水平进行检测，发现miR-27amimic组SIPA1L3蛋白表达水平显著低于miR-27amimic NC组SIPA1L3蛋白表达水平，miR-27a inhibitor组SIPA1L3蛋白表达水平显著高于miR-27a inhibitorNC组SIPA1L3蛋白表达水平，即高表达miR-27a能够明显降低SIPA1L3的蛋白表达水平，低表达miR-27a则能够显著提升蛋白的表达水平。

综上所述，miR-27a随着宫颈组织的病变程度加重，表达水平显著提升，且能够通过调控其下游靶基因SIPA1L3的表达促进Siha细胞的增殖并抑制其凋亡，进而促进了肿瘤的发生发展。