生鲜乳中芽孢杆菌的危害与控制措施

李建洲，邵伟，陈贺，李明，赵艳坤

（1.新疆农业大学动物科学学院新疆肉乳用草食动物营养实验室，乌鲁木齐 830052；2.新疆农业科学院农业质量标准与检测技术研究所/农业部农产品质量安全风险评估实验室/新疆农产品质量安全实验室，乌鲁木齐 830091）

生鲜乳被誉为人类的“白色血液”，因其富含丰富的营养成分，成为各种微生物滋长的天然培养基[1]。随着人们生活水平的提高，更加关注乳及乳制品的质量安全。生鲜乳作为乳制品加工的原料，其微生物含量的多少直接影响乳及乳制品的质量。芽孢杆菌作为生鲜乳中重要的食源性致病菌之一[2]，可在具有充足营养条件的生鲜乳中不断增长，产生蛋白分解酶和脂肪分解酶，改变或降解乳蛋白结构，使乳蛋白凝胶化或产生带有苦味的苦肽。研究表明，当芽孢杆菌达到一定数量后，可破坏生鲜乳成分，造成乳品腐败，严重影响乳及乳制品质量安全，危害人类健康，是乳品行业不容忽视的重要问题。基于此，本文主要介绍生鲜乳中芽孢杆菌的危害，分析挖掘其产生危害的机制，并讨论相应控制措施，找出生鲜乳芽孢杆菌的关键风险点，为有效控制其危害提供理论参考。

1 芽孢杆菌的生物学特征

芽孢杆菌（Bacillus）是一类产生抗逆性内生孢子的好氧或兼性厌氧的杆状细菌。一般可发酵许多糖类，多数为产气菌，广泛存在于土壤、空气和水中。菌体呈短链或长链状，可产生位于菌体中央或偏一端的芽孢，能够在营养物质匮乏的情况下得以存活，因能产生对紫外线、热电磁辐射和某些化学物质有很强抗性的芽孢[3]，且这种芽孢休眠体能够通过生物膜的黏附作用在不同环境中稳定生存，故难以在乳产品加工过程中被彻底消除。同时，在营养充足的情况下，芽孢可以和营养萌发剂进行触发。芽孢在与萌发剂混合后，芽孢核和胞壁会随着水分的进一步摄取而膨胀，核内的蛋白逐渐恢复流动性，相关蛋白的酶活性也得到恢复，等到萌发结束后，芽孢对外界不良环境的抵抗力完全消失，开始启动代谢活动，成为一个正常的营养细胞[4]。即使在惰性状态下，孢子依然能感知到微量养分，快速做出无性细胞生长的响应。因此，芽孢杆菌不仅能在高温下生长，低温下也同样能得以生存。

2 生鲜乳中芽孢杆菌的分类及其危害

生鲜乳中的芽孢杆菌根据耐热性可分为两类：第一类是嗜热芽孢杆菌，主要包括嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus，B.stearothermophilus）、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus，B. pumilus）等[5]，可产酸或酶使生鲜乳变味导致乳制品变质；第二类是嗜冷芽孢杆菌，主要包括枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，B. subtilis）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus，B. cereus）等。当生鲜乳中芽孢杆菌达到一定数量，会导致乳品加工后芽孢杆菌残留，嗜冷或嗜热芽孢杆菌的耐冷耐热机制会对乳及乳制品造成不同程度的危害。

2.1 嗜冷芽孢杆菌

嗜冷芽孢杆菌是生鲜乳中危害最大的嗜冷菌之一。Eneroth等[6]研究表明，在生鲜乳中，60%的腐败由嗜冷芽孢杆菌引起。常见的嗜冷芽孢杆菌有枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌等。同样，蜡样芽孢杆菌是研究最多的嗜冷芽孢杆菌，其生长温度为15℃～20℃，但在0℃仍可滋生。孢子常常处于休眠期，遇到适宜的条件会使其复苏，受热激发促进生长[7]，因此具有很强的生存能力。

2.1.1 枯草芽孢杆菌

枯草芽孢杆菌是一种好氧、短杆状且周生鞭毛能运动的革兰氏阳性菌，最适生长温度为28～50℃；生长pH值为5.5～8.5；可水解淀粉；菌落表面粗糙，菌体呈污白色或微黄色，有皱褶，可产色素[8]。

枯草芽孢杆菌在不利条件下生成抗逆性孢子，能耐受生产、加工运输等恶劣条件，是在厌氧条件下还能繁殖的一种需氧菌[9]，它会利用蛋白质淀粉以及糖类来分解色氨酸形成吲哚，从而液化明胶，还原硝酸盐以及水解淀粉[10]。枯草芽孢杆菌在自然界分布很广，可从干草、饲料和空气散落到生鲜乳中，所以常常从生鲜乳中检出，易导致生鲜乳出现凝块、苦味、酸味和腐败味[11]。据有关报道[12]，最难灭活的是枯草芽孢杆菌，其对周围环境有较强的适应性和耐受能力，同时也是引起生鲜乳贮藏时腐败变酸的主要原因。

闫坤等[13]将生鲜乳分别处于30℃、40℃、50℃、60℃条件下超声处理60s，研究生鲜乳中枯草芽孢杆菌的杀菌效果与温度的关系，试验发现随着温度升高杀菌率显著增加，在30℃的条件下杀菌效果不明显，但在40℃、50℃、60℃条件下杀菌效果不断上升。综合试验得出结论：随着时间与温度的不断增加，杀菌效果也更加明显，杀菌率达到96.77%，但枯草芽孢杆菌中的芽孢在高温下仍能存活，这为枯草芽孢杆菌可产生耐热水解酶提供了有力证据。

王英丽等[14]使用超高压杀菌实验表明，在压力处理过程中乳蛋白质、乳脂肪和乳糖以及食盐等对芽孢杆菌都有一定的缓冲保护作用，而且这些营养物质加速了芽孢杆菌的繁殖，提高了芽孢杆菌的自我修复功能。研究得出，生鲜乳中枯草芽孢杆菌生长与死亡的最佳压力参数为40℃下200～700 MPa施压5min、压力循环7次，其杀死枯草芽孢杆菌芽孢的致死率为99.9991%，从而为枯草芽孢杆菌的抗耐受压力提供了理论依据。

2.1.2 蜡样芽孢杆菌

蜡样芽孢杆菌是广泛存在于灰尘、饲料、污水、植物、土壤和空气等环境中的革兰氏阳性的食源性致病菌，对乳品行业构成严重威胁。它最低生长温度为4～5℃，最高生长温度为48～50℃。对不良环境特别是对热具有很强的抵抗力，导致63～85℃的普通巴氏杀菌对其没有任何影响[15]。典型的蜡样芽孢杆菌能产生酪蛋白酶、卵磷脂酶，能液化明胶。同时可以产生位于菌体中央或稍偏一端的芽孢，能在营养匮乏的条件下以芽孢的状态存活较长时间。因此，蜡样芽孢杆菌对环境生存适应性强，在周围环境中广泛存在。

蜡样芽孢杆菌常存在于奶罐及加工场所的机械管道，由于耐热芽孢的存在，生鲜乳生产加工后的运输、储藏、销售等环节均易受到该菌的污染，从而引起产品的腐败变质[16]。蜡样芽孢杆菌的一些菌株具有致病性，可产生致吐、致腹泻的肠毒素，极易污染食物引起食物中毒。早在1973年，Bulyba等[17]即报道了蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒，人在食用被蜡样芽孢杆菌污染的食物后，会在8～16h内呈现呕吐或腹泻的中毒症状，可能还会致使眼部感染，导致心内膜炎、脑膜炎和菌血症等疾病。其常见的毒素有呕吐毒素、腹泻毒素[非溶血肠毒素（Nhe）、溶血素BL（Hbl）和细孢毒素K（CytK）][18]。崔一芳等[19]从生鲜乳样品中分离到一株产高水平呕吐毒素的蜡样芽抱杆菌CAU45，同时建立了小鼠单次灌胃和兔单次耳缘静脉注射呕吐毒素的两种动物模型，发现小鼠的中毒症状和肝脏损伤情况随呕吐毒素攻毒剂量的增大而加重，其中雌性小鼠中毒症状比雄性小鼠更为明显；呕吐毒素在兔体内的毒物代谢动力学研究表明，其平均滞留时间为9.6±2.9h，消除半衰期为10.8±9.lh，兔在注射呕吐毒素后30min即导致肝脏损伤。得出结论蜡样芽孢杆菌产出的高水平呕吐毒素可致人中毒。

蜡样芽孢杆菌除了能产生毒素以外，还能形成生物膜，生物膜是菌体在自然界中一种常见的生存状态[20,21]。在乳品加工环境中，生物膜对乳制品的加工有着重要的影响。部分蜡样芽孢杆菌通过产生生物膜而附着在不锈钢的乳品加工设备表面和管道内壁，且生物膜难以完全去除，这为蜡样芽孢杆菌在加工环境中的存活和繁殖提供了基础，并可能导致乳制品的污染[22,23]。

2.2 嗜热芽孢杆菌

嗜热芽孢杆菌菌体呈短杆状；芽孢为椭圆形，芽孢囊膨大；兼性好氧，不具有运动性；最适生长温度为55℃，最高温度可达63℃；最适pH值为7.8；主要脂肪酸是isoC-16∶0。嗜热芽孢杆菌作为生鲜乳中存在的一类耐热菌，严重影响乳及乳制品的质量安全，当嗜热芽孢杆菌达到一定数量时，一些芽孢杆菌如嗜热脂肪芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌等在高温下也不能被消灭，同时在储存情况下容易被重新激活，从而能够水解α酪蛋白（a-casein）和β酪蛋白（β-casein），使乳脂肪球和酪蛋白表面结构遭到破坏，引起脂肪与酪蛋白聚集并结合，使乳蛋白发生水解，酸度增大[24]。

2.2.1 嗜热脂肪芽孢杆菌

嗜热脂肪芽孢杆菌呈长杆状，多数为单个，少数成对或链状排列；需氧或兼性厌氧；芽孢呈椭圆或柱状，最佳生长温度56～60℃，不耐酸，pH值在5.0以下就会停止生长，能利用葡萄糖产酸但不产气。嗜热脂肪芽孢杆菌是芽孢杆菌属中最耐热的微生物，但其营养细胞面对不良条件时非常敏感。若低至一定温度，营养细胞就会立即失去活性[25]。武玉艳等[26]对热协同超高压对不同介质中嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的灭活作用进行了研究，结果表明：在600 MPa/40℃，保压30min的条件下，生鲜乳中嗜热脂肪芽孢杆菌的失活率大大增加。

嗜热脂肪芽孢杆菌是引起低酸性食品酸败的典型菌种。赵新淮等[27]利用嗜热芽孢杆菌检测生鲜乳中抗生素的残留研究表明，当生鲜乳中不存在抗生素残留或抗生素残留低于检出下限时，嗜热脂肪芽孢杆菌在60～65℃条件下生长，分解糖类产生有机酸，使pH下降，致酸碱指示剂发生颜色变化，呈阴性结果。此结果印证了嗜热脂肪芽孢杆菌耐高温的特点。此外，由于嗜热脂肪芽孢杆菌繁殖分解乳糖产酸，故会导致生鲜乳pH下降，产生不良气味，乳及乳制品变质腐败。

2.2.2 短小芽孢杆菌

短小芽孢杆菌呈细杆状；生长温度约为30℃；可水解淀粉酶；该菌菌落有半透明型和不透明型两种形态，在传代过程中半透明菌落可产生半透明和不透明型菌落各一半，而不透明菌落只产生少许半透明菌落，且传至第4代时半透明型菌落消失。

邱秀宝等[28]从土壤样品中通过筛选获得一株产脂肪酶LipS6的短小芽孢杆菌，测定后发现，脂肪酶LipS6的最适温度为30℃，酶活以最适温度为中心，呈上升或下降趋势，热稳定性测定表明该脂肪酶稳定性较差。同时最适pH值为9.0，为碱性脂肪酶，pH在8～10之间均具有较高相对酶活性，pH稳定性试验表明该酶的pH稳定性范围较宽，pH在7～11的缓冲液中存放3h残余酶活仍保持80%以上，说明耐碱性能优越。

于婷等[29]针对短小芽孢杆菌BSH-4产生的抗菌物质粗提液测定了热稳定性、pH稳定性、紫外照射稳定性、蛋白酶稳定性，发现BSH-4产生的抗菌粗提液具有良好的热稳定性，在100℃下处理60min后其抑菌活性仅下降10%左右，而且对蛋白酶稳定，这为生鲜乳中鉴别短小芽孢杆菌提供了依据。除热稳定性外，短小芽孢杆菌BSH-4产生的抗菌物质还具有良好的耐紫外照射稳定性，且对乙醚和丙酮不敏感，表明短小芽孢杆菌BSH-4产生的抗菌物质有可能适应特殊而复杂的环境。

3 芽孢杆菌对生鲜乳的危害机制

胡启桥等[30]研究认为，若生鲜乳中芽孢数过多，热灭菌下仍会有残留，灌装后可存在于各产品中。当养分耗竭时，芽孢杆菌一般处于休眠状态，但在产品冷藏、运输、销售过程中，一旦遇到适宜条件就会被激活，会逐渐转化为芽孢杆菌的营养细胞，不断生长繁殖，从而引起生鲜乳及乳制品中的蛋白质、脂肪分解，脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶的活性增强，可将体内酶原激活为有活性的酶。相应的会有蛋白质和脂肪分解产生的腐败味与酸败味，并导致乳糖产酸使甜炼乳变黏稠而产气。

另外，如果贮存条件不当，牛场达到标准的生鲜乳送到奶站时会降低至30%，再经过一定时间后会降低至10%，所以贮存条件及运输温度与时间成为影响芽孢杆菌数量最主要的因素。生鲜乳在加工前应保持低温贮存，这在很大程度上可抑制芽孢杆菌生长。

3.1 产生蛋白酶

蛋白酶是一种水解酶，可催化肽键水解，例如嗜热芽孢杆菌能产生2种蛋白酶：RM-76Ⅰ金属蛋白酶（67.6kD）和RM-67Ⅱ丝氨酸蛋白酶（20kD）。两种蛋白酶催化最优的pH值为8.0[31]。芽孢杆菌分泌蛋白酶最多的时期是在产孢子之前的稳定期前期的指数期后期[32]。

韩永霞等[33]进行了7株芽孢杆菌产酶性能测定试验，包括2株解淀粉芽孢杆菌、3株枯草芽孢杆菌、2株地衣芽孢杆菌，分别接种这7株芽孢杆菌于酪素培养基以及淀粉培养基上生长并分解蛋白或淀粉。结果表明，解淀粉芽孢杆菌产酶能力最大，地衣芽孢杆菌产酶能力不占优势，不同菌株芽孢杆菌产酶能力不同。对嗜热脂肪芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌进行最佳产酶条件的试验可知，地衣芽孢杆菌产生的蛋白酶为碱性蛋白酶，蛋白酶在培养温度为50℃，pH9.0左右酶活力达到最高；嗜热脂肪芽孢杆菌产生的蛋白酶为高温、中性蛋白酶，蛋白酶在培养时间为70℃，pH7.5～8.0时酶活力达到最高，因此可得知芽孢杆菌产蛋白酶最旺盛时期为对数生长末期，进入稳定期细胞生长速度放慢之后，芽孢形成和蛋白酶合成与分泌都受到对数生长末期复杂的生理调节系统控制。根据蛋白酶作用的最适pH值可分为酸性、中性和碱性蛋白酶。产生中性蛋白酶的主要菌种包括枯草芽孢杆菌和耐热解蛋白芽孢杆菌。在生鲜乳中，芽孢杆菌产生的蛋白酶大部分属于丝氨酸蛋白酶，而丝氨酸蛋白酶又属于碱性蛋白酶，pH值为7.25时最有利于蛋白酶的合成。丝氨酸蛋白酶接触无机盐后迅速生产，破坏乳蛋白的分解，加速不饱和脂肪酸游离，酸度升高。同时，丝氨酸蛋白酶与生鲜乳凝固有直接关系，是引起生鲜乳产生胀气和酸败的主要原因[34]。

3.2 产生脂肪酶

生鲜乳中的脂肪属于中性脂肪，占乳脂质的97～99%，是乳的重要组成成分。Bacillus在生长繁殖过程中分泌脂肪酶，脂肪酶可使生鲜乳中脂肪发生脂解反应产生游离脂肪酸，进而影响生鲜乳风味。生鲜乳中脂肪酶分为内源性和外源性脂肪酶，外源性脂肪酶主要是微生物脂肪酶[35]。

耐热芽孢杆菌分泌出的脂肪水解酶能使生鲜乳脂肪发生水解，酸度增大。Choi等[36]认为耐热芽孢杆菌所分泌的脂肪水解酶水解生鲜乳中脂肪后释放出的脂肪酸多为长链酸，对酸败风味不会产生影响。但生鲜乳中的脂肪酶活性加大，会破坏乳中的不饱和脂肪酸，导致蛋白质凝集、脂肪上浮，脂肪酸氧化产生酸败味。

3.3 产生α-淀粉酶

淀粉酶是催化和水解淀粉生成大分子糊精、低聚糖及葡萄糖等产物的一类酶总称。按水解淀粉后生成糖类的端基异构类型差别，将淀粉酶分为α-淀粉酶、β-淀粉酶等，其中尤以α-淀粉酶最为常用。β-淀粉酶可以通过沃尔登转位反应，将产物由α型转变为β型[37]。

淀粉酶的两大来源为植物和微生物，并且集中在细菌和真菌中。芽孢杆菌所产的淀粉酶较多，是因为Bacillus属中能产生淀粉酶的菌种较多，如枯草芽孢杆菌、嗜热芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌。王磊等[38]分离了36株芽孢杆菌并测定其产酶活性，发现其中4株均可产生淀粉酶且淀粉酶分泌能力较强，且不同菌株产淀粉酶能力与产α-淀粉酶能力不同。该试验为探究生鲜乳中芽孢杆菌的α-淀粉酶提供了依据。目前，国内外关于生鲜乳中芽孢杆菌淀粉酶的研究较少，机理尚未明确，α-淀粉酶与其危害机制还有待进一步深入探究。

4 生鲜乳中芽孢杆菌的防控措施

利用HACCP体系可以有效提升生鲜乳的芽孢杆菌的控制能力。HACCP（Hazard Analysis and Critical Control Point）全称为危害分析与关键控制点，是一种经济有效的食品安全控制体系。

生鲜乳的优劣是产品质量保证的根本。因此，对生鲜乳生产过程中固有的风险进行分析，制定出能够控制风险的预防措施及完善的监督检验体系，并使其有效运行，即可保证安全可靠的生鲜乳供应与乳制品的质量。目前HACCP体系正逐步成为国际性的食品安全监管手段，其在生鲜乳中的防控应用办法详见表1。

表1 生鲜乳中芽孢杆菌的防控办法[39～41]

针对我国生鲜乳微生物质量安全现状，在全国范围内加强企业牛场饲养管理和制订相应卫生管理条例至关重要。特别在夏季，要特别注意推进规模化养殖，保持挤奶厅消毒卫生，注意奶罐低温保存，运输过程避免温度过高。应将生产过程全部纳入HACCP与DHI体系，以把控微生物含量，减少生鲜乳中的芽孢杆菌污染。

5 总结

综上所述，生鲜乳中芽孢杆菌的优势菌为枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌及短小芽孢杆菌；可采用16SrRNA基因序列比对分型图谱的方法来探寻生鲜乳中目标优势菌株的污染。芽孢杆菌在适宜条件下可产生蛋白酶、脂肪酶和α-淀粉酶等降解酶，可导致生鲜乳乳成分、风味、色泽发生变化，导致乳品酸败。针对生鲜乳中芽孢杆菌的危害，可根据不同控制点实施不同的控制办法。应尽快建立一套适应我国生鲜乳质量安全现状的防控体系，切实运作好危害关键控制点，加强生鲜乳中芽孢杆菌的风险评估，严格把控生鲜乳中芽孢杆菌数量，尽快统一生鲜乳中芽孢杆菌的限量标准，以保证消费者“舌尖上的安全”，促进我国乳业的健康可持续发展。