一例夏南牛大肠杆菌与链球菌混合感染的病例报告

刘心，彭清洁，郭爱珍,2，陈曦,2，陈颖钰,3

（1.华中农业大学动物医学院，武汉 430070；2.华中农业大学农业微生物国家重点实验室，武汉 430070；3.湖北省兽医流行病学国际科技合作基地，武汉 430070）

1 病例介绍

2018年3月26日，国家肉牛牦牛产业技术体系疾病控制研究室/华中农业大学反刍动疾病研究室收到一份死亡公牛样本，待确诊死因。

通过对畜主的问询得知，该场位于河南省驻马店市，死亡牛只为1头夏南种公牛。该公牛2018年3月25日下午一切正常，26日早上5点突然死亡，病死原因不明。之后立即进行解剖并将组织病料送检。

2 病理学诊断

夏南种公牛尸体外表无明显异常，心、肺、肾无明显异常；肝脏有大量黑色病灶，切开有淤血点；脾明显肿大，实质如泥，结构模糊；肠胃结合部有化脓病灶；膀胱表面有大量出血点（ 图1）。

图1 牛内脏剖解图

对各脏器进行组织切片检查，结果显示：肝脏有出血性坏死；心脏淤血、水肿、传导纤维变形；脾脏红髓区充满红细胞，淋巴细胞稀少；肾小球管扩张、肾上皮组织坏死、变性；膀胱出血、坏死；肠淋巴小结形状不规则，红细胞显著增多，淋巴细胞减少，呈坏死性肠炎；肺出血、肿大，呈浆液性肺炎；胆囊组织黏膜纤维性坏死（图2）。

图2 病理切片图（×400倍）

3 细菌学检测

3.1 组织触片

剪取一小块肝脏，取切片进行触片，并进行革兰氏染色。结果显示肝脏存在有链球菌感染（如图3所示）。

图3 肝脏组织触片及革兰氏染色结果，箭头所示为链球菌（×100倍）

3.2 细菌培养及鉴定

取各组织样品均匀涂布于营养琼脂进行细菌培养。对生长出来的阳性菌落提取基因组，进行 16SrRNA PCR 扩增并进行测序。结果显示，肝脏、淋巴结、膀胱、肠、脾脏中存在有大肠杆菌感染；胃中有福氏志贺杆菌感染；淋巴结中有链球菌（如图4所示）。

图4 细菌革兰氏染色结果（×100倍）

3.2.1 大肠杆菌的特性测定

3.2.1.1 血清型鉴定

为了确定大肠杆菌血清型，进一步做了玻片凝集试验，用参考血清因子鉴定所分离的大肠杆菌，结果显示该大肠杆菌血清型为O158。

3.2.1.2 药敏试验

为确定最佳治疗方案，对分离培养的大肠杆菌进行红霉素、庆大霉素、氟苯尼考、卡那霉素、环丙沙星、左氧氟沙星及四环素的药敏试验，发现分离菌株只对庆大霉素和氟苯尼考敏感（表1）。

表1 大肠杆菌分离株的药敏试验结果

3.2.1.3 毒力检测

将大肠杆菌分离株按2.0×108/mL、4.0×108/mL和8.0×108/mL分别接种小鼠，每只小鼠接种0.2mL，同时设立空白对照，观察24h。2h后接种小鼠出现嗜睡、反应迟钝症状，4h后开始死亡，24h内全部死亡。对照组无症状和死亡。死亡小鼠解剖发现肝脏、脾脏、肠内容物呈深红色，腹腔有积液（图5）。将腹腔积液、肝脏、脾脏组织接种TSA、麦康凯培养基培养，结果显示能够分离到大肠杆菌O158。

图5 接种小鼠出现明显病理变化

3.2.1.4 毒力因子鉴定

提取大肠杆菌基因组DNA进行astA基因PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳检测，发现其条带大小约111bp。将PCR产物送测序公司测序，确定结果为astA型（图6）。

图6 大肠杆菌astA基因PCR扩增

3.2.2 链球菌特性鉴定

3.2.2.1 毒力测定

将链球菌分离株接种小鼠，剂量与大肠杆菌相同，结果24h内小鼠死亡。

图7 链球菌不同浓度攻菌死亡鼠：2.0（左）、4.0（中）、8.0（右）×108/mL,0.2mL/只

对死亡小鼠进行解剖，发现肝脏、脾脏、肠内容物呈淡红色，腹腔有积液（图7）。取小鼠组织到TSA平板上进行细菌分离，分离到链球菌。

3.2.2.2 血清型鉴定

利用农业微生物学国家重点实验室的现有参考血清因子，未鉴定出链球菌的血清型。

4 结论

根据病原检测结果，结合解剖、小鼠攻毒情况，诊断该死亡牛为肠致病性大肠杆菌0158和链球菌混合感染。

5 临床处理方案建议

虽然利用常用的链球菌参考血清因子未鉴定出分离株的血清型，但经过一系列的实验室检测与小鼠毒力试验，确定该公牛的发病和病死原因是致病性大肠杆菌0158和链球菌混合感染。感染导致脾、肝、心等脏器的变性坏死，出现急性败血症性死亡。

结合药敏试验结果，对临床防治方法建议如下：

（1）对于亚急性病例，治疗参考药敏试验结果，用庆大霉素、氟苯尼考等药物进行抗菌治疗，并辅以输液等对症治疗法。

（2）预防本病：一是加强饲养管理，加强牛舍卫生。避免皮肤和饲料被粪便污染，牛舍要彻底消毒。同时加强对食物和水源的管理，避免经食物和水传播肠出血性大肠杆菌。二是对犊牛采取有效防制措施：犊牛初生后在24h内需获得足量高质量的初乳，在冬季和春季要避免冷应激的刺激，以免影响免疫球蛋白的吸收；新生犊牛应单独饲养、不宜群养，应保持清洁卫生。