低氧对蠕虫和细菌混合感染小鼠肠道黏膜免疫功能的影响※

周义玲，张 昱，纪巧荣，寇 娜，穆罕默德·杰马，袁周阳，刘 杰，韩 莹，申香群，张 伟，3△

(1.青海大学医学院，中国 西宁 810001；2.浙江省台州医院，中国 台州 318000；3.青海省高原医学应用基础重点实验室，中国 西宁 810001)

高原低氧是否会对肠道黏膜免疫系统在抵御外源性微生物过程中产生影响尚不明确。本研究以十二指肠感染了鼠多形螺旋线虫Heligmosomoidespolygyrus(H.polygyrus，Hp)和肠道鼠枸橼酸杆菌Citrobacterrodentium(C.rodentium，Cr)的小鼠为模型，探讨低氧对蠕虫和细菌混合感染小鼠肠道黏膜免疫功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

8周龄SPF级BALB/c雌鼠30只，体重(18±2)g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0006。动物的使用和处理经过青海大学医学院实验动物伦理委员会批准。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物分组与造模

小鼠饲养于温度为(20±2)℃、相对湿度为(40±5)%的IVC鼠笼中，适应性饲养1周后随机分为6组：常氧对照组(Control组。青海西宁，海拔2 260m：大气压582mmHg，PO2121.6mmHg)、低氧对照组(H-Control组。低压舱：海拔5 000m，大气压405mmHg，PO284.7mmHg)、常氧H.polygyrus感染组(Hp组)、低氧H.polygyrus感染组(H-Hp组)、常氧H.polygyrus和C.rodentium混合感染组(Hp+Cr组)、低氧H.polygyrus和C.rodentium混合感染组(H-Hp+Cr组)，每组5只。首先将Hp+Cr组和H-Hp+Cr组感染H.polygyrus(L3期幼虫200条/只)，1周后再感染C.rodentium(2.5×109CFU/只)，感染(C.rodentium)两周后开腹(无菌)取材。为了保证造模条件的一致性，其余四组的处理时间均为第3周最后一天。在造模期间称量小鼠体重以观察其在低氧和感染条件下的体重变化。

1.2.2H.polygyrus和C.rodentium活化

镜下观察显示4 ℃下储存的L3期H.polygyrus幼虫活动度良好，计数H.polygyrus幼虫并经口感染小鼠(L3期幼虫200条/只)，感染3周后取材并收集小鼠粪便培养，培养1周后收集新的L3期H.polygyrus幼虫于试管中并保存于4 ℃冷藏柜备用。Hp+Cr组和H-Hp+Cr组感染H.polygyrus一周后再感染C.rodentium。首先在C.rodentium(strain DBS100；ATCC number 51459)冻干粉中加入无菌水，复溶后取菌液在麦康凯琼脂平板上进行培养(37℃，过夜)，其余菌液分装冻存于-80 ℃冰箱，次日取一个菌落在LB液体培养基中培养，待菌液变浑浊后检测其吸光度值并计算相应的浓度及体积。

1.2.3 实验动物取材

将小鼠用CO2麻醉后于心脏取血，静置2 h后离心(3381g)10 min，收集血清备用；用75%酒精消毒后开腹，取出小肠测量其长度；取十二指肠上段沿纵切面剖开，镜下分检H.polygyrus并计数；截取0.5 cm十二指肠行OCT包埋做常规冰冻切片。应用酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测血清中IgE、IgG1抗体浓度。

1.3 实验试剂

抗小鼠1stAb、标准品和抗小鼠2ndAb(IgE、IgG1)均购自美国BD公司；辣根过氧化物酶、TMB显色液及浓硫酸购自上海玉博生物科技有限公司；OCT购自美国Sakura Finetek公司；HE染料购自珠海贝索生物技术有限公司。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 小鼠外在表现

Control组和Hp组整体表现良好，无明显异常。Hp+Cr组小鼠在感染细菌5～7天后，状态萎靡、便稀软、脊柱隆起、毛发枯燥，有轻微的便血；H-Hp+Cr组各项症状出现较早，且明显为重。

2.2 小鼠体重

小鼠体重变化见图1。重复测量分析小鼠体重变化：各组小鼠体重变化符合线性关系，F=154.971，P<0.01，两两比较采用LSD检验，Hp+Cr组和H-Hp+Cr组小鼠体重均低于相应的单纯感染组(P<0.05)，Hp组与Control组比，小鼠体重无明显变化，而合并C.rodentium感染时，体重明显降低(P<0.05)，提示单纯H.polygyrus感染对小鼠体重无明显影响；各低氧组小鼠体重均低于常氧组(P<0.05)，其中以H-Hp+Cr组小鼠体重降低最为明显，显示低氧处理会使小鼠体重降低。

图1 小鼠体重变化量图

Figure 1 Changes Mice Body weight

2.3 小鼠小肠长度

小鼠小肠长度见表1。结果显示：与Control组相比，Hp组和Hp+Cr组的小肠明显增长(P<0.05)。Hp组与Hp+Cr组比较无显著性差异。与H-Control组相比，H-Hp组和H-Hp+Cr组小肠均增长(P<0.05)。各低氧组小肠长度均长于相应的常氧组(P<0.05)，提示低氧条件会使小肠长度增长。

表1 小鼠小肠长度

*：与Control组比较，P<0.05；#：与Hp组比较，P<0.05；◆：与Hp+Cr组比较，P<0.05；●：与H-Control组比较，P<0.05

2.4 小鼠十二指肠H.polygyrus数目

十二指肠H.polygyrus数目见表2。与Hp组比较，Hp+Cr组H.polygyrus数目明显增多，有显著性差异(P<0.05)；H-Hp+Cr组H.polygyrus数目较H-Hp组多(P<0.05)；各低氧感染组H.polygyrus数目明显多于相应的常氧组(P<0.05)。其中，H-Hp+Cr组H.polygyrus数目最多。

表2 小鼠十二指肠H.polygyrus的数目

GroupnThenumberofH.polygyrusHp580.6±8.1H-Hp5114.0±11.7#Hp+C595.2±9.8#H-Hp+Cr5142.5±13.3◆■F- 27.284P- 0.000

#：与Hp组比较，P<0.05；◆：与Hp+Cr组比较，P<0.05；■：与H-Hp组比较，P<0.05

2.5 小鼠血清抗体浓度

血清抗体浓度见表3。与Control组相比，Hp组和Hp+Cr组血清IgE、IgG1浓度均明显升高(P<0.05)，其中Hp+Cr组IgE浓度高于Hp组(P<0.05)，而IgG1则相反。与H-Control组相比，H-Hp组和H-Hp+Cr组血清IgE浓度均明显升高(P<0.05)，且H-Hp+Cr组IgE浓度高于H-Hp组，有显著性差异(P<0.05)；与H-Control组相比，H-Hp组IgG1浓度明显升高(P<0.05)，H-Hp+Cr组IgG1浓度无明显变化，且H-Hp+Cr组IgG1浓度低于H-Hp组。H-Hp组和H-Hp+Cr组IgE浓度明显低于相应的常氧组；低氧H-Hp+Cr组IgG1浓度低于Hp+Cr组。

表3 小鼠血清免疫球蛋白含量

Table 3 The concentration of serum immunoglobulin in mice

*：与Control组比较，P<0.05；#：与Hp组比较，P<0.05；△：与Cr组比较，P<0.05；◆：与Hp+Cr组比较，P<0.05；●：与H-Control组比较，P<0.05；■：与H-Hp组比较，P<0.05；★：与H-Cr组比较，P<0.05

2.6 小鼠十二指肠形态

十二指肠形态学变化见图2。Control组十二指肠组织结构完整，黏膜基本完好，肌层厚薄均匀；H-Control组表现为轻微黏膜破损，与Control组比无明显差异；Hp组、H-Hp组、Hp+Cr组和H-Hp+Cr组均有不同程度的形态学改变，H-Hp+Cr组尤为明显，十二指肠组织结构完整性破坏明显，黏膜破损严重，上皮大量脱落，并伴有明显的炎细胞浸润至固有层和肌层。

A：Control组，十二指肠组织结构基本完整，肌层厚薄均匀；B：H-control组，有轻微的黏膜破损；C：Hp组，黏膜破损较Control组明显，有炎细胞浸润；D：H-Hp组，破损较Hp组明显；E：Hp+Cr组，有明显的上皮脱落和炎细胞浸润；F：H-Hp+Cr组，破坏最严重，有大量的上皮脱落及炎细胞浸润至固有层和肌层

图2 小鼠十二指肠形态变化图(HE staining，×200)

Figure 2 Morphological changes of duodenum in mice(HE staining，×200)

3 讨论

肠道黏膜是机体免疫系统最大也是最为复杂的部分[1]，作为阻止肠道病原菌入侵的第一道防线，对于维持机体健康起着至关重要的作用。当机体受到寄生虫、细菌等外界病原体入侵时[例如像导致严重婴幼儿腹泻的肠致病性大肠杆菌(Entero-pathogrnicEscherichiacoli，EPEC)感染[2]]，肠道黏膜免疫系统就会发挥相应的免疫调节机制来保护机体免受伤害。H.polygyrus是一种自然源性的啮齿类动物肠道线虫[3]，主要寄生于小鼠十二指肠。当感染H.polygyrus时，宿主就会产生以Th2型免疫反应为主的免疫功能来预防和清除寄生虫。青藏高原常见的细粒棘球绦虫，其幼虫寄生于人或家畜，为人兽共患病，称为包虫病。主要流行于我国西北牧区，其幼虫进入机体后也可刺激机体产生Th1、Th2免疫反应，其诱导的Th2型免疫反应为主导反应[4]。因此，研究H.polygyrus感染的免疫学机制，可为早期预防和诊断高原包虫病提供理论基础。C.rodentium是一种定植在结肠末端的革兰阴性杆菌，是小鼠特异性的细菌病原体，有研究表明其编码黏附功能的基因与EPEC具有功能同源性[5]，因此很适合研究EPEC的发病机制。

本研究记录了整个小鼠疾病过程中体重的动态变化。结果显示，各低氧组体重均低于常氧组，提示在高海拔低氧状态下，机体由于应激反应，使肠道缺血缺氧加重[6]，从而抑制胃肠运动，导致食欲减退。另外，低氧混合感染组体重明显低于低氧蠕虫感染组和低氧对照组，说明在低氧条件下，蠕虫合并细菌感染时，加重了对消化功能的影响，最终引起体重减轻。

研究结果显示，常氧和低氧条件下蠕虫感染组和混合感染组小鼠小肠长度均增长。本实验团队前期的研究结果也表明蠕虫感染时小肠长度增长可能与肥大细胞活化脱颗粒及分泌型上皮细胞增多有关；各低氧组小肠长度明显长于相应的常氧组，是由于缺氧会引起胃肠道反应性减弱、胃肠平滑肌舒张。镜下分检H.polygyrus并计数发现，各混合感染组H.polygyrus数目明显多于单纯蠕虫感染组，提示合并C.rodentium感染时，C.rodentium会影响机体对H.polygyrus的排除；各低氧感染组H.polygyrus数目明显多于常氧感染组，可能是由于低氧条件引起肠黏膜缺血、缺氧加重、小肠蠕动减弱等导致机体对H.polygyrus的清除能力减弱。

IgE是一种由黏膜下淋巴组织中的浆细胞分泌的免疫球蛋白，在肠道黏膜免疫系统的形成及抵抗病原体入侵中起着越来越重要的作用[7]，近年来，有研究[8，9]表明，IgE在肠道寄生虫感染者血清中的含量显著升高。本实验结果显示，在常氧和低氧条件下单纯蠕虫感染组和混合感染组血清中IgE的浓度明显升高，而混合感染组IgE的浓度明显高于蠕虫感染组，可能与C.rodentium感染影响H.polygyrus数目增多有关。另外，Th2型细胞因子白介素-4(IL-4)可通过多种途径活化B细胞，诱导IgE合成，使血清中IgE的水平升高[10]，本实验团队尚未发表的研究结果显示，混合感染组肠系膜淋巴结细胞分泌IL-4水平升高，这可能也是混合感染组IgE浓度明显升高的原因。

IgG是血清和细胞外液中含量最高的免疫球蛋白，是全身性体液免疫的主要效应分子，在机体抗感染免疫中起着重要作用。有研究[11]表明，寄生虫感染时伴有高水平的IgG1，本实验结果也显示在常氧和低氧条件下各感染组的IgG1水平明显升高，但混合感染组IgG1水平则低于单纯蠕虫感染组，提示C.rodentium也会影响H.polygyrus诱导的Th2型免疫反应。各低氧感染组IgE的浓度均明显低于各常氧感染组，IgG1的浓度与相应的常氧感染组相比也有下降趋势，提示低氧会影响IgE、IgG1的产生。SaiRam M等研究[12]表明，低氧下免疫球蛋白浓度明显降低，与本实验结果一致。

综上所述，本研究通过模拟低氧条件下肠道蠕虫和细菌混合感染模型，研究低氧对混合感染小鼠肠道黏膜免疫功能的影响。结果显示，低氧暴露会损伤肠黏膜且使血清IgE、IgG1抗体浓度降低，影响肠道黏膜免疫系统发挥其免疫功能，加重H.polygyrus和C.rodentium导致的肠道损伤。机体的免疫应答包括先天性免疫和适应性免疫应答，后者又包括主要由T细胞参与的细胞免疫应答，以及B细胞所介导的体液免疫应答。本实验中我们主要对低氧条件下体液免疫应答的改变进行了简单分析，还应进行高海拔低氧暴露对机体固有免疫应答和特异性细胞免疫应答影响的相关研究，包括T细胞分泌细胞因子的检测，本实验团队正在做相关的实验研究；对于参与肠道黏膜免疫系统的各项信号通路的检测也极其重要，本实验团队正在做相关计划，以完善有关高原低氧对肠道黏膜免疫系统影响的研究。