从氧感知通路的新发现谈未来高原医学研究的机遇※

格日力

(青海大学高原医学研究中心，西宁 810001)

2019年诺贝尔生理学或医学奖获得者哈佛医学院的威廉·凯林(William G.Kaelin)、牛津大学的彼得·拉特克利夫(Peter J.Ratcliffe)和霍普金斯大学的格雷格·塞门扎(Gregg L.Semenza)教授对氧感知通路的新发现，使得人体如何感受氧浓度的奥秘从分子水平上破解，继而机体在氧不足环境下的适应及不适应机制被进一步阐明。本文简要解读氧感知通路的相关内容及我国在这个领域的研究简况。

1 氧感知通路的研究历程

众所周知，氧是所有生命体能量代谢过程中必须的元素，生物体的一切生命活动都需要能量，能量的最主要来源是食物，而氧气则是细胞将食物营养转化为能量不可缺少的条件。长期以来，人们致力于氧气对人体的整体作用研究，而我们的细胞如何感知氧、适应氧的机制研究稍显薄弱。荣获2019生理医学奖的三位科学家经过27年的潜心研究，揭示了氧气是如何在细胞之中起作用的，人体从整体水平上如何适应低氧环境变化的，从而进一步精准地解释了有关新陈代谢、免疫及人体对于高原的适应等科学问题。三位科学家对细胞氧感知通路研究的贡献既有相互印证，又有各自独特的发现。

1.1 Semenza团队发现了缺氧诱导因子-1(HIF-1)。1992年，华人学者王广良在Semenza的实验室从事博士后研究期间，首次克隆低氧诱导因子蛋白，随后又分离纯化和鉴定了HIF-1，明确提出HIF-1是由含有碱性螺旋—环螺旋结构的HIF-1α和HIF-1β亚单位组成的异源二聚体转录因子[1，2]，基因分别定位于14q21-24和lq21。1995年，王广良和Semenza的研究证实了HIF-1是通过红细胞和血管新生介导了机体在低氧条件下的适应性反应[3]。这些成果分别发表在生物化学(JBC)和美国科学院院刊(PNAS)等杂志，第一作者均为王广良先生，他的工作为2019年诺贝尔生理医学奖的获奖成果奠定了重要基础。

1.2 Ratcliffe团队阐明了细胞如何感知低氧的机制。1993年，Ratcliffe等利用瞬时基因转染技术研究促红细胞生成素(EPO)基因3′(EPO 3′)的转录增强子，发现氧气感知系统不仅在肾脏和肝脏细胞中存在，还在哺乳动物细胞中广泛存在[4]。1994年，Ratcliffe发现了在低氧诱导下，糖酵解过程中的重要基因也出现了类似EPO基因被诱导表达的现象[5]，说明HIF-1不仅仅在机体水平上负责调控缺氧的适应，而且在细胞水平上参与调节糖酵解的速率。这个结果与Semenza团队的工作有相似之处。

1.3 Kaelin团队首次揭示了抑癌蛋白(VHL)的功能，发现了VHL蛋白可以通过氧依赖的蛋白水解作用负性调节HIF-1。Kaelin是一位临床医生，专攻希佩尔-林道综合征(VHL disease)，他发现这类遗传性疾病患者，由于VHL基因的突变而导致某些癌症的发生。罹患这类肿瘤者常会有异常的新生血管形成，其血管内皮生长因子(VEGF)和EPO也明显增高。因此他自然而然地想到，缺氧通路可能参与这种疾病的发生。1999年，Kaelin在自然杂志报道了VHL基因突变与HIF基因调节之间的关系[6]。随后Kaelin和Ratcliffe的研究发现了脯氨酰羟化酶(PHD)在VHL蛋白识别HIF-1的过程中发挥着重要作用，并阐明了HIF-1α的基因激活功能可受到氧气依赖性羟基化作用的调节[7]。2001年，Kaelin团队报道了HIF-1α在氧气存在的情况下，PHD停止羟基化，随后通过介导与VHL泛素蛋白连接酶复合体VHL-E3结合，致HIF-1α被降解，无法诱导低氧基因表达，从而证明机体在常氧下，降解VHL需要通过VHL与HIF-1α的相互作用实现[8]。

2 什么是氧感知通路

当生物体内缺氧时细胞需要做出相应的改变，通过调整细胞内的信号，做出积极的反应，避免缺氧造成严重的细胞损伤，并且努力恢复氧供应，改变缺氧状态。因此，哺乳动物细胞如何感知低氧、适应低氧、恢复供氧，这就是“细胞氧感知通路”的核心。细胞对低氧的适应性调节是通过改变一系列基因表达来实现的。调控这些基因表达最重要的转录因子是低氧诱导因子-1(HIF-1)，而调节HIF-1的关键分子是脯氨酰羟化酶，它作为氧感受器能够直接感受氧分压，调节HIF-1基因表达。1992年，Semenza等从低氧处理细胞中分离到一种蛋白质，该种蛋白广泛存在于慢性缺氧细胞中，结合点位于EPO的3′端增强子第一部分；该蛋白质低氧时稳定，常氧时消失(降解)，故命名低氧诱导因子[1，8]。因此，低氧是稳定HIF-1α的关键因素。那么氧究竟是如何影响HIF-1α稳定性的呢？2001年，Kaelin和Ratcliffe等发现[9]，在常氧状态下，HIF结构域中的PHD发生羟基化，羟基化修饰后的 HIF-1α迅速与VHL蛋白结合，经泛素-蛋白酶途径迅速被降解，无法诱导低氧基因表达。但在低氧状态下，PHD羟基化致HIF反应受阻，胞浆内HIF-1α积聚增多并转入核内，与HIF-1β聚合成异源二聚体，继而与下游靶基因的低氧反应元件(HRE)结合，诱导低氧相关基因的转录表达，形成低氧反应调节通路(图2)。氧感知通路，不仅在基础科学上有其价值，还有望带来创新的疗法。比如通过调控HIF-1通路促进红细胞的生成治疗贫血。

3 氧感知通路与高原适应机制

青藏高原平均海拔4 000米以上，空气氧气量仅为海平面的63%，藏族人群在青藏高原生活了几万年，是世界上居住高原时间最长且适应最佳的民族。以往各国科学家对藏族人群低氧适应的生理学机制做了大量研究，但细胞氧感知通路在藏族人高原适应过程中起什么角色仍是未解之谜。近年来，中国科学家在国际上首次报道了藏族人的EGLN1、PPARA、EPAS1等基因发生高频序列变异。而这些基因，就是细胞氧气感知反应通路中的关键基因。

当缺氧状态时(左图)，HIF-1α被保护免于降解，积聚在细胞核中，与低氧调节基因中的特定DNA序列(HRE)结合，以此促进低氧靶基因表达，增加细胞适应性。当正常氧状态时(右图)，HIF-1α被蛋白酶体迅速降解。氧气通过向HIF-1α添加羟基(OH)来调节降解过程，随后，VHL蛋白可以识别HIF-1α并与之形成复合物，从而导致其以氧依赖性方式降解

图1 有氧状态和缺氧状态下的氧感知通路(http：//www.laskerfoundation.org/awards/show/oxygen-sensing-essential-process-survival/)

曾长青等应用全基因组筛选藏族人群中的自然选择信号，发现位于2号染色体上的EPAS1基因的选择信号最强，EPAS1是HIF通路中的重要基因。[10]EPAS1基因单体型频率在汉族和藏族人群中分别为2%和46%，发现非编码区31个SNP与血红蛋白浓度相关，纯合基因型个体血红蛋白浓度比杂合型低0.8±0.15 g/dL。在低氧环境中，由于激活了EPAS1基因，触发生成更多的红细胞和血红蛋白，从而导致高原红细胞增多症。然而，藏族人由于EPAS1基因发生了变异，导致藏族人只要轻微提高红细胞和血红蛋白水平，便可降低慢性高原性疾病的发生。笔者的课题组与美国相关机构合作，应用高通量基因组芯片筛选出10个藏族人特有的正选择信号，其中EGLN1、EPAS1、PPARA等基因与低氧诱导因子通路有关(图2)。[11]对这些基因的基因型与表现型关联分析发现，EGLN1基因的表达与血红蛋白浓度呈明显负相关，基因每表达1个拷贝，血红蛋白浓度平均降低1.7 g/dL。藏族人EGLN1基因的D4E和C127S等两个位点出现高频率的错义突变[9]，大约88%的藏族人都携带突变的EGLN1基因。对基因功能研究发现，EGLN1基因D4E位点错义突变者对低氧耐受性很强，能阻止红细胞过度增生。因此，藏族人高原病发病率较低、运动耐力较强可能与EGLN1基因突变有关。

藏族人群特有的与高原适应相关的三个(EGLN1、EPAS1、PPARA)低氧适应基因与氧感知通路有关

图2 高原低氧适应基因与HIF-1α通路[引自Simonson等，Science(2010)]

4 氧感知通路与高原运动训练

二十世纪60年代科学家发现，低氧导致机体内红细胞数量增加，而红细胞的增多是由于低氧刺激肾脏分泌大量EPO所致。那么低氧是如何增加EPO含量的？90年代初，Semenza等从低氧培养细胞中分离到一种蛋白质，这种蛋白叫做HIF-1α的蛋白[1，3]。在缺氧的环境下，HIF-1α能够激活许多哺乳动物细胞内的特定基因，如它可调控EPO、VEGF、GLUT1(葡萄糖转运蛋白1)等基因的表达。低氧环境下EPO基因的过度表达，会增加血液中红细胞数量和血红蛋白含量，使机体对氧的携带和运输能力增强。依据这个原理，科学家在世界范围广泛开展高原运动训练的理论与实践研究。居住在青藏高原的多布杰(西藏)、切阳什姐(青海)，以及东非高原、阿比西尼亚高原等地的世居高原运动员，在耐力性竞赛项目中取得了优异成绩。说明他们不仅在心肺功能方面，甚至从分子生物及遗传学方面有着对低氧环境的最佳适应，使他们具有天生的耐力优势。高原训练提高运动技能的基本生理学机制是在低氧环境下，刺激肾脏释放EPO，增加血红蛋白浓度和增强氧传送链，以此提高组织对氧的有效利用率和骨骼肌的耐乳酸能力。Hoppeler等通过肌肉活检[12]测定运动员高原训练前后的HIF-1和VEGF发现，低氧环境下进行强度训练时这些因子的基因显著高表达，而在常氧下增加的程度较低，提示低氧性训练可促使HIF-1的基因转录，加速机体在分子生物学和结构上的适应，进而增加骨骼肌氧传送和氧利用量，提高运动能力。然而，高原训练的效果存在着很大的个体差异，而这些差异与EPO对低氧反应的个体差异有关。Richalet发现[13]，在6452 m高度逗留3周期间，EPO的增加和随后血红蛋白的增加均具有显著个体差异。笔者曾在美国选择48名运动员暴露于低压氧舱(模拟海拔1780～2800m)进行间歇性低氧训练[14]，结果发现暴露低氧6 h和24 h后血清EPO含量的升高存在显著个体差异(-41%～+400%，图3)。后续的研究发现，EPO对那些对低氧有反应的运动员，通过高原现场训练可显著提高运动成绩，而那些无反应者的高原训练成绩无明显提高甚至下降，提示在高原低氧环境中HIF-1α诱导EPO基因的表达对提高高原训练成绩起重要作用。

48名运动员暴露低压低氧6、24h后血清EPO浓度的百分比。显示EPO对低氧的变化显著的个体差异

图3 暴露于不同海拔高度血清EPO浓度变化[引自格日力等，J ApplPhiol(2002)]

5 结语

低氧感应信号通路的发现开创了一个全新研究领域，具有重要的理论价值和巨大的临床应用潜力。以前期科研成果为驱动力，通过对低氧信号通路的深入研究，有望在高原世居人群和平原移居人群对低氧环境适应机制研究上取得重要成果，为进一步揭示高原性疾病，包括慢性高原病、高原肺水肿、低氧性肺动脉高压等疾病发生发展的分子机制找到新的方向和途径，并因此找到能够预防和治疗这类疾病的方法。