不同急性低氧条件下SD大鼠肺肥大细胞的变化趋势※

刘 杰，曹成珠，纪巧荣，周义玲，韩 莹，袁周阳，张 伟

(青海大学高原医学研究中心；高原医学教育部重点实验室；青海省高原医学应用基础重点实验室，青海大学医学院病理生理学教研室，青海 西宁 810001)

低压低氧环境是引发各种急、慢性高原病的关键因素[1，2]，在众多的急性高原病中高原肺水肿(HAPE，high altitude pulmonary edema)发病率高、危害大。AHPH发生机制涉及血管反应、神经调控、免疫应答、生化代谢、基因表达和分子信号转导等的异常改变[3，4]。低氧应激下肥大细胞(Mast cells，MCs)活化、脱颗粒与肺水肿、肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension，PAH)形成的研究是近期研究热点，本研究拟探讨不同急性低压低氧条件(模拟不同海拔高度、低氧刺激时间)下SD大鼠肺水肿发生情况；肺MCs的变化趋势。

1 材料与方法

1.1 实验动物的饲养

健康SD大鼠，72只，SPF级，雄性，体重272.96±15.88 g，由江苏南京市青龙山动物繁殖场提供，许可证号：SCXK(苏)2017-0001，合格(苏州大学检测)证号：201803296。大鼠运到青海大学医学院动物饲养室[海拔2260m，通风饲养橱，清洁；22℃；12：12昼/夜交替；自由摄取标准维持颗粒饲料(北京科澳协力饲料有限公司)、水]饲养1 w后随机分组实验。动物实验遵循《实验动物管理条例(2017年修订)》。

1.2 主要仪器和试剂选择

低压舱(实验动物低压模拟舱，HCPⅢD800，西安富康空气净化设备工程有限公司)；HE(苏木素-伊红)染色试剂盒(717033，BASO珠海贝索生物技术公司)，TB染色试剂盒(D034，南京建成公司)，SP检测试剂盒(SP9001和SP9002，中杉金桥公司)；Tryptase 抗体(ab2378，abcam公司)，Chymase抗体(ab233103，abcam公司)；戊巴比妥钠(071025，上海泰瑞尔公司)。

1.3 实验

1.3.1 低压低氧实验动物分组

大鼠随机分成三个大组(每大组N=24)：NC组(常氧对照组，海拔2260m)，H5K组(低压舱，模拟海拔5000m)，H7K组(低压舱，模拟海拔7000m)，每大组分别分成四组(每组n=6)：12 h、24 h、48 h、72 h组。各组动物用苦味酸标记后，将NC组动物置于动物饲养室(海拔2260m)，H5K、7K各组动物分别置于低压舱(分别模拟海拔5000m、7000m)12、24、48、72 h进行造模。

1.3.2 肺组织取材、固定、切片

采用充气式肺循环灌注固定后取材：动物造模完成后立即用戊巴比妥钠(50mg/kg，i.p.)麻醉[5]，采取仰卧位固定、切开颈正中处行气管插管，给肺脏充气(10cmH2O)，打开胸腔，剪开心包腔充分暴露心脏，剪开左心房，在右心室插管至肺动脉，用0.9% NS灌注(20cmH2O)至双肺变白，改用4%多聚甲醛溶液灌注至双肺变硬，结扎气管，完整剪下双肺浸泡在4%多聚甲醛溶液中过夜，将肺组织切成小块(约15mm×15mm×2mm)置于4%多聚甲醛溶液浸泡，用1×PBS液洗涤后行梯度酒精脱水、石蜡包埋、切片(5μm)。

1.3.3 染色、形态学观察

石蜡切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化、1×PBS浸洗后进行以下实验：

①行常规HE染色后观察肺组织的显微结构变化。②行TB染色后观察肺组织MCs的形态、分布，计数TB阳性细胞数(每张切片随机选取5个含肺细小动脉高倍镜视野，计数5个视野中的MCs数)。③通过IHC实验观察Tryptase、Chymase表达情况、观测Tryptase、Chymase阳性细胞数量(阳性细胞计数：每张切片随机选取5个含肺细小动脉高倍镜视野，计数5个视野中的核蓝染、胞浆黄染的Tryptase、Chymase阳性细胞数)。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 肺组织HE染色结果

光镜40倍下观察，与NC组比较，H5K各组肺组织未发现明显异常；H7K-12、24 h组可见肺泡间隔有增宽，H7K-48、72 h组肺泡间隔有明显的增宽，肺泡壁肿胀，血管内皮细胞可见明显肿胀，肺间质水肿程度重于H7K-12、24 h组，并偶见轻度肺泡内肺水肿以及肺泡中出现RBC，见图1。

红色箭头指示肺间隔变宽、渗出、内皮细胞肿胀等病理改变情形

图1 SD大鼠肺组织HE染色图(40×)

Figure 1 HE Staining in different group of lung tissue in SD rats(40×)

2.2 肺组织TB染色结果

光镜下观察发现NC各组肺组织中在微小血管旁偶见MCs，其体积小、数量少；低氧各组MCs数量明显增多，细胞体积较NC组大，且H7K各组多于H5K各组，各低氧组中MCs在肺微小血管旁、气管粘膜下间质、肺被膜上均有分布，其形状、大小不一，并见部分细胞有明显的脱颗粒情况，见图2所示，统计结果见表1。

红色箭头指示肺间隔变宽、渗出、内皮细胞肿胀等病理改变情形

图2 SD大鼠肺组织TB染色图(40×)

Figure 2 TB Staining in different group of lung tissue in SD rats(40×)

Table 1 Statistic number of TB positive cells in lung tissue of SD rats at different altitudes and different hypoxic times

*：与12 h比较，P<0.05；a：与CN组比较，P<0.05；b：与H5K组比较，P<0.05；c：与H7K组比较，P<0.05

通过TB阳性细胞计数并统计学分析：①同一低氧时间不同海拔高度间比较发现，TB阳性细胞数量呈现H7K组>H5K组>NC组的趋势，差异具有统计学意义；②同一海拔高度不同低氧时间下NC、H5K四组间比较均无统计学差异；H7K-12 h组>H7K-24、48、72 h组，差异有统计学意义，H7K-24、48、72 h组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 肺组织IHC结果

通过IHC法观察肺组织Tryptase和Chymase阳性细胞表达情况，Tryptase和Chymase阳性细胞均为胞浆着色，光镜下阅片发现NC各组肺组织中Tryptase和Chymase阳性数量少，低氧各组Tryptase和Chymase阳性数量明显增多，且H7K 各组多于H5K各组。Tryptase和Chymase阳性细胞在肺微小血管旁、细小支气管旁、气管粘膜下间质、肺被膜上均有分布，形状、大小、颜色深浅不一。不同组SD大鼠肺组织Tryptase和ChymaseChymase的表达图分别见图3、4。

图3 不同组SD大鼠肺组织Tryptase的表达图(40×)

Figure 3 Expression of Tryptase in lung tissue of different groups in SD rats(40×)

图4 不同组SD大鼠肺组织Chymase的表达图(40×)

通过Tryptase和Chymase阳性细胞计数并行统计学分析：①同一低氧时间不同海拔高度间比较发现，Tryptase和Chymase阳性细胞数量呈现H7K组>H5K组>NC组的趋势，差异具有统计学意义，②同一海拔高度不同低氧时间，Tryptase和Chymase阳性细胞在各自NC四组间、H5K四组间比较无统计学差异(P>0.05)；H7K-12 h组>H-7K24、48、72 h组，差异有统计学意义，H7K-24、48、72 h组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。不同海拔高度不同低氧时间SD大鼠的肺组织Tryptase、Chymase阳性细胞数目分别见表2、3。

组别n12h24h48h72hFPNC组65.33±1.975.83±2.145.72±2.325.06±2.580.100.96H5K组619.50±2.88a21.67±5.01a22.50±5.05a17.33±3.08a1.890.16H7K组659.67±5.85ab40.00±3.58ab∗35.67±4.27ab∗34.33±4.84ab∗37.330.00F 307.94 124.02 81.89 96.52 - -P 0.00 0.00 0.00 0.00 - -

*：与12 h比较，P<0.05；a：与CN组比较，P<0.05；b：与H5K组比较，P<0.05；c：与H7K组比较，P<0.05

Groupn12h24h48h72hFPNC组65.00±1.415.50±2.076.33±3.506.33±2.500.420.74H5K组617.50±3.9418.17±4.8316.50±1.8719.17±3.870.530.67H7K组647.83±5.85ab33.50±3.08ab∗34.00±3.90ab∗32.67±6.38ab∗12.650.00F 169.03 95.21 113.84 50.42 - -P 0.00 0.00 0.00 0.00 - -

*：与12 h比较，P<0.05；a：与CN组比较，P<0.05；b：与H5K组比较，P<0.05；c：与H7K组比较，P<0.05

将TB染色、Tryptase和Chymase 的IHC结果分别做同一低氧时间、不同海拔高度和同一海拔高度、不同低氧时间的统计学分析，结果见图5、6。

a：与CN组比较，P<0.05；b：与H5K组比较，P<0.05

图5 同一低氧时间、不同海拔高度不同指标变化统计图

Figure 5 Statistical chart of different indexes in the same hypoxia exposure time at different altitude

图6 同一海拔高度、不同低氧时间不同指标变化统计图

通过图5、6清晰地观察出海拔7 000 m高度、低氧刺激12 h 时SD大鼠肺组织中MCs数量最多、Tryptase和Chymase阳性细胞数最多，反映出此时MCs活性最强。

3 讨论

急性低氧是导致AHPE发生的关键因素，有大量文献认为通过实验动物低压模拟舱即可完成急性低压低氧动物模型的复制，但对条件设置观点不一。本课题组根据已有的文献和本实验研究中心的条件，选择低压舱模拟不同的海拔高度以及不同低氧持续时间开展实验，摸索出相对合理、经济、可行的实验条件。本实验CN组动物放置于本中心动物饲养房内(西宁，海拔2230m)，H5K组、H7K组实验动物放置于低压舱内(H5K组：模拟海拔5000m，相对青海平均海拔含氧量为14.28%；H7K组：模拟海拔7 000 m，相对青海平均海拔含氧量为10.75%)。大鼠在不同低氧环境中持续放置12、24、48、72 h均无死亡情况。各组动物肺组织HE染色后于40倍光镜下观察，与CN组比较，H5K-48、72 h有轻度的肺间质性改变；H7K各组肺泡间隔均有明显的肺间质型肺水肿，血管内皮细胞肿胀，H7K-48、72 h组肺泡内有液体及RBC渗出，发生肺泡型肺水肿并出血。经同一时间不同海拔高度和同一海拔高度不同时间两种方法对比观察发现，H7K组肺水肿程度重于H5K组。由以上实验结果推断在低压舱海拔7 000 m复制SD大鼠急性肺水肿效果优于海拔5 000 m。

AHPE的发生机制尚不明确，从病理生理学角度认识AHPE主要涉及肺动脉压(Pulmonary artery pressure，PAP)过度升高、肺毛细血管通透性增高和肺泡上皮对水清除障碍三方面。目前本课题组主要拟从急性低氧引发HPV(Hypoxie Pulmonary Vasoconstrietion，缺氧性肺血管收缩)导致PAP过度升高的角度研究AHPE的发生机制。HPV是由急性低氧应激引发，其生理意义在于减少缺氧肺泡周围的血流，使血液流向通气充分的肺泡，甚至可增加肺尖部的血流，促发肺内血流重新匹配，以保证肺换气的高效完成，可见HPV是维持通气/血流比(VA/Q)相适应的自身代偿性保护机制[6]，但肺动脉收缩过强会引发PAP升高和血流阻力增加，甚至微血栓的形成，成为缺氧性肺血管收缩(Hypoxie Pulmonary Vasoconstrietion，HPV)发生的重要机制。

本实验中HE染色结果发现，H7K组肺组织中细微动脉的内皮细胞肿胀，由扁平形变成椭圆形、圆形，推测可能是由于急性低压低氧刺激导致内皮细胞受损、肿胀，促发细微动脉管腔变窄，进而可诱发管内血细胞的粘附聚集，甚至发生管内局部DIC，致血流阻力变大，引发PAP升高。甚至推测此类微小血管壁完整性遭到破坏，是导致急性低压低氧大鼠肺泡间隙增宽，发生急性间质性肺水肿、肺泡性肺水肿的原因。由此推测急性低氧刺激下内皮细胞受损、肿胀，无肌性细微动脉管腔变窄、管壁通透性增高促进了PAH和AHPE的发生。

HAPE的发生除了高原低压低氧引起的PAP升高以外，还与低氧应激性免疫反应、无菌性炎症等发生导致促炎-抗炎介质平衡失控、免疫调节异常密切相关。免疫细胞中的MCs是I型变态反应的核心细胞，是连接变态反应诱导阶段与效应阶段的纽带，被确定为过敏和炎症反应关键性的受动细胞[7，8]。肺脏是MCs的主要栖居地之一，主要分布于肺血管周围、支气管周围和内壁、平滑肌及粘液腺内等“门户”部位，这种特殊的选择性空间分布提示：MCs可能在肺免疫监督方面起着重要的“哨兵”作用[9]。也有学者认为MCs发挥免疫调节等多种中介功能，对微观环境起着 “一线微调器”作用[10]。1967年Bergofsky等提出高原低氧时血管周围出现大量MCs，推测从肺泡弥散来的低浓度的O2刺激MCs，它可能是一种化学感受器，在适当的解剖位置上控制着肺泡氧分压，MCs释放的组胺可调节肺小血管收缩，对抗低氧反应。NovotnT等[11]研究发现低氧刺激MCs脱颗粒与肺血管重构密切相关，并有明显的时间相关性。Montani D等[12]发现PAH患者重塑的肺血管周围出现超过50%C-Kit呈阳性的MCs，并通过释放介质参与PAH的发生。近年来MCs与PAH的形成机制研究得到广泛重视，在原发或继发的PAH模型动物的肺组织中MCs数量会增加5～6倍[13，14]，75%的MCs围绕在肺小动脉周围，尤其在直径为20～50 μm的肺血管周围聚集率较高，并有明显的脱颗粒现象。MCs被誉为PAH中肺血管重构的“催化剂”。可见慢性低氧刺激MCs增多促进慢性PAH发生的报道已较多，本课题组主要研究急性低压低氧应激下AHPE发生过程中MCs的变化。

本实验中通过TB染色、MCs计数及统计学分析发现，低氧各组MCs数量明显增多，MCs数量呈现H7K组>H5K组>NC组的趋势，H7K-12 h组MCs数量最多，MCs在肺微小血管旁、气管粘膜下间质、肺被膜上分布增多，其形状、大小不一，并见部分MCs有明显的脱颗粒情况。

Tryptase是由MCs生成的四倍体丝氨酸蛋白酶，是MCs所特有的、含量最多的蛋白(Tryptase占MCs分泌颗粒总蛋白量的30 %～50%以上，β-Tryptase占细胞总蛋白含量的20%)，目前Tryptase已作为MCs活化和脱颗粒的特异性激活标志物，可直接反映MCs数量多少和活性程度。Chymase也是MCs主要的中性丝氨酸蛋白酶家族成员，含量占MCs总蛋白的3%以上(仅次于Tryptase)，也是MCs重要的特异性激活标志物。MCs分为两类：一类只富含Tryptase，称为MCT，另一类富含有Tryptase和Chymase，称为MCTC[15]。有文献报道，MCT增加在机体免疫防御反应中发挥重要作用，MCTC可能主要参与血管生成和组织重塑[16]。本实验通过IHC法检测Tryptase和Chymase阳性细胞发现，H5K、H7K各组Tryptase和Chymase阳性细胞明显增多，呈现H7K组>H5K组>NC组的趋势，其中H7K-12 h组Tryptase和Chymase阳性细胞数目均最多，差异具有统计学意义，与TB染色结果相一致。由IHC实验结果可见急性低氧刺激下SD大鼠肺组织MCs数量增多，主要是MCTC数量增多，MCs数量增加并活化脱颗粒释放胞内活性介质。由低压低氧实验结果可推测急性低压低氧可导致AHPE发生，可刺激MCs(主要是MCTC)数量增加、活化和脱颗粒，依据文献分析本实验MCs(主要是MCTC)数量的增加可能原因是，MCs在急性低氧刺激下发生快速募集和激活的自身放大作用，进而发生MCs活化、释放生物活性介质的“瀑布效应”[17]。

Giaid等[18]研究表明，肺泡缺氧可使肺血管周围MCs去极化，释放血管活性物质使肺内微小血管收缩，这一过程与Ca2+内流有关。本实验发现急性低压低氧刺激MCs数目增加、活性增强，发生了脱颗粒。由此实验结果推测急性低压低氧刺激下肺内MCs快速募集、活化、脱颗粒释放了胞内的活性介质，如5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、组胺(Histamine，His)、Chymase和肾素(Renin)等活性物质可直接或间接收缩肺小血管。(1)5-HT：①5-HT作为一种血管收缩因子，可直接引起肺血管收缩[19]。②5-HT可加强NE(Noradrenaline，去甲肾上腺素)等物质的缩血管效应，使肺小血管严重痉挛、PAP升高和血流阻力增大，严重者发生肺水肿、肺出血。(2)His：是一种血管活性物质，内源性His具有升高PAP的作用。His与H2-R结合有扩张血管作用，能明显增加局部血流量和血管通透性，His与肺小血管H1-R结合，迅速激活G蛋白-PLC(Phospholipase C，磷脂酶C)信号通路，触发胞内Ca2+浓度迅速升高，引起肺血管收缩。(3)Chymase：Chymase是体内最强有力、特异的血管紧张素转化因子，可以不依赖ACE(Angiotension converting enzyme，血管紧张素转换酶)促进局部Ang I转化为Ang II，Chymase途径是Ang I转化成Ang II的三种途径之一，在人体和大鼠体内大约有70%～80%的Ang II由Chymase途径转化生成，激活RAAS(Renin-angiotension system，肾素-血管紧张素系统)[20-22]。(4)Renin：肺MCs可以合成和分泌肾素到组织间隙，肾素裂解生成Ang I，Ang I在ACE、MCs来源的Chymase和/或MMP-9作用下，在局部生成Ang II。Ang II有较强的收缩血管的作用，提高肺血管紧张度，升高PAP。由此，急性低氧刺激致MCs数量增加、活化并快速爆发式脱颗粒，释放胞内活性介质，进而促进肺血管收缩、PAP升高，严重者导致AHPE甚至肺出血的发生，由此也可解释本实验中肺水肿的发生的时间滞后于MCs增多的时间的现象。

本实验结果提示低压舱模拟海拔7 000 m高度低氧环境复制SD大鼠急性肺水肿以及促进MCs(主要是MCTC)数目增多、活性增强的效果好于海拔5 000 m，并发现海拔7 000 m高度12 h组MCs数量最多、活性较高。基于此实验基础，为了更进一步探讨急性低氧MCs总数量和脱颗粒现象相对最明显的时间，以及深入研究肺MCs在进行缺氧性PAH和AHPE发生中的作用和发生机制，可在少于低氧刺激12 h的基础上再逐步减少低压低氧暴露时间继续进行实验研究。