桥本甲状腺炎鼠动情周期子宫内膜半乳糖凝集素-1含量变化

高伟伟，李 莉，樊 华，杨 昊，柳田田，王 囡，朱德发

桥本甲状腺炎属于自身免疫性疾病之一，主要发生于女性人群[1]。研究[2]显示，不孕女性具有较高的桥本甲状腺炎发生率。因此，对桥本甲状腺炎与女性妊娠的关系进行深入研究尤为重要。人及哺乳动物的子宫内膜经过短暂的“着床窗口期”才允许胚胎着床，这一过程受到各种信号物质、细胞因子的调节。半乳糖凝集素家族成员在免疫调节、炎症反应以及肿瘤细胞的浸润、转移等一系列生理过程中发挥着重要作用[3]。既往，半乳糖凝集素-1(galactose agglutinin-1, galectin-1)在肿瘤疾病的发生、进展、转移等方面的相关研究较多，由于胚胎着床和肿瘤转移的生物学行为存在高度相似，因此近年来galectin-1于生殖领域中的相关研究日益增多。有研究[4]报道，galectin-1与妊娠的维持和成功存在一定相关性，被认为可能是子宫内膜容受性的标志物之一。鉴于此，现通过研究子宫内膜厚度的改变及galectin-1、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-17a(interleukin-17a，IL-17a)含量关系，为临床研究桥本甲状腺炎和不孕的关系提供线索，同时为桥本甲状腺炎患者不孕症的治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物选取8～9周龄的清洁级健康NOD雌性小鼠共40只，体质量20～23 g,均购自北京华阜康生物科技有限公司，饲养于安徽医科大学病理科实验室。所有小鼠均予以自然昼夜节律光照，控制室内温度20～24 ℃、湿度40%～60%，适应性饲养7 d。小鼠实验方式严格遵守伦理学原则，且与安徽医科大学实验动物管理相关条例相符。

1.2 研究方法

1.2.1桥本甲状腺炎造模 40只小鼠随机均分为2组，经7 d适应性饲养后，取25 μg的猪甲状腺球蛋白加入100 μl的PBS溶液中混匀，按照1 ∶ 1的比例取弗氏完全佐剂与猪甲状腺球蛋白溶液混合在研钵之内，并于冰浴上研磨，直至其呈“油包水”状。固定小鼠，采用一次性注射器抽取已制备好的乳状剂于尾根部行皮下注射，注射剂量为0.1 ml。14 d后按照1 ∶ 1的比例将弗氏不完全佐剂和猪甲状腺球蛋白混合制成乳化液，随后按照上述方式进行操作。对照组小鼠注射等量不含有猪甲状腺球蛋白的弗氏完全佐剂进行干预。造模成功与否由病理实验室工作人员进行判定，成功模型的主要表现为甲状腺滤泡结构发生较为严重的破坏，且淋巴细胞浸润比较明显。

1.2.2动情周期确定 主要分为动情前期、动情期、动情后期、动情间期，周期为4～5 d，在小鼠造模周期结束后1周内进行小鼠阴道脱落细胞瑞士染色涂片，在确定动情周期后立即取静脉血，以颈椎脱臼法处死小鼠。

1.2.3标本制备 迅速取出小鼠的完整“Y”形子宫，并从子宫分叉处剪断。将左半子宫放置于4%的多聚甲醛中固定24 h，行石蜡包埋，作矢断面连续切片，片厚5 μm，用于HE以及免疫组化染色。另一侧子宫以4%的多聚甲醛固定，用于组织匀浆待行细胞因子检测。

1.2.4血清抗甲状腺球蛋白抗体(thyroglobulin antibody，TgAb)、甲状腺抗过氧化物酶抗体(thyroid peroxidase antibody，TPOAb)、三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine，T3)、四碘甲状腺原氨酸(tetraiodothyronine，T4)、促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)水平检测 确定动情周期后的小鼠进行乙醚吸入法麻醉处理，随后打开腹腔将下腔静脉充分暴露，进行下腔静脉采血。以3 000 r/min离心10 min，取上层血清保存在4 ℃的冰箱中待检。电化学发光免疫分析法检测血清T3、T4、TgAb、TPOAb，ELISA法检测血清TSH，具体操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.5染色 ① HE染色：小鼠子宫予以脱蜡、复水处理，以苏木精染色20 min，随后予以脱水处理，并于透明后烘干封片，采用光学显微镜进行图片的拍摄。② 免疫组织化学染色：取小鼠子宫蜡片进行脱蜡、水化、阻断内源性过氧化物酶操作，并以柠檬酸盐微波炉加热暴露抗原决定簇，以山羊血清封闭。上述各项操作结束后均采用PBS重复3次洗涤，3 min/次。加入galectin-1抗体(1 ∶ 50)于室温下孵育1 h后转移至4 ℃条件下孵育过夜，采用PBS洗涤，DAB显色，苏木精复染，常规脱水、透明、封片。随机选取每张切片高倍镜下5个视野，采用IPP6.0图像分析软件进行免疫反应产物观密度值的分析，取平均吸光度(average optical density,AOD)值。

1.2.6mRNA获取 采用TRIzol试剂盒提取总RNA，并通过逆转录获取cDNA，随后以PCR扩增技术获取mRNA，其中PCR反应体系20 μl，包括5 μl 2×SYBR Green mixture，正向(10 μmol/L)与反向引物(10 μmol/L)各1 μl，cDNA 1 μl，核糖核酸酶游离水 2 μl，总RNA 10 μl。反应条件如下：95 ℃、2 min，95 ℃、5 s，60 ℃、10 s，共40个循环。其中galectin-1正向引物为GCCTCCATGTGTTCTTGGTC，反向引物为CTCACCCTCTGTGGTCACTT。

1.2.7采用流式微球捕获技术(CBA) 以CBA 人Th1/Th2/Th17细胞因子试剂盒检测组织匀浆TNF-α、IL-17a水平。具体操作严格按照试剂盒说明书进行，试剂盒购自美国BD公司。

1.2.8观察指标 分别比较2组小鼠血清TgAb、TPOAb、T3、T4、TSH水平，HE染色镜下拍照，多功能图像分析仪测量动情期的子宫内膜厚度水平，动情期、动情前期、动情后期、动情间期galectin-1 mRNA表达情况，组织匀浆TNF-α、IL-17a水平。

2 结果

2.1 两组小鼠血清TgAb、TPOAb、T3、T4、TSH水平对比观察组小鼠血清TgAb、TPOAb水平相比对照组较高(均P<0.05)。见表1。

2.2 两组小鼠动情周期的子宫内膜厚度水平对比观察组小鼠动情期子宫内膜厚度相比对照组更厚(P<0.05)。见表2、图1。

2.3 两组小鼠动情周期galectin-1 mRNA表达情况对比观察组小鼠动情各期galectin-1 mRNA表达水平相比对照组降低(P<0.05)。见表3。

2.4 两组小鼠动情周期galectin-1 蛋白的AOD对比观察组动情期和动情后期的galectin-1 蛋白的AOD值均较对照组更低(P<0.05)，而在动情前期和动情间期的AOD值与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

2.5 两组小鼠组织匀浆TNF-α、IL-17a水平对比观察组小鼠组织匀浆TNF-α、IL-17a水平相比对照组较低(均P<0.05)。见表5。

表1 2组小鼠TgAb、TPOAb、T3、T4、TSH、水平

与对照组比较：*P<0.05

表2 两组小鼠动情期的子宫内膜厚度水平对比

与对照组比较：*P<0.05

表3 两组小鼠动情周期galectin-1 mRNA表达情况对比

与对照组比较：*P<0.05

图1 2组小鼠子宫内膜动情周期 HE×100

表4 两组小鼠动情周期galectin-1蛋白的AOD对比

组别动情期(n=8)动情前期(n=4)动情后期(n=4)动情间期(n=4)观察0.165 7±0.002 9∗0.083 1±0.002 50.081 4±0.002 1∗0.042 8±0.002 7对照0.201 8±0.003 60.082 9±0.002 30.139 7±0.002 00.043 3±0.002 6t值22.0880.11840.2070.267P值<0.0010.910<0.0010.799

与对照组比较：*P<0.05

表5 两组小鼠组织匀浆TNF-α、IL-17a水平对比

与对照组比较:*P<0.05

3 讨论

近年来的研究[5]发现不孕症女性合并桥本甲状腺炎的几率高于生育能力正常的女性，这提示了桥本甲状腺炎与不孕症存在密切相关。本文采用猪甲状腺球蛋白于尾根部行皮下注射，建立桥本甲状腺炎模型。病理下观察甲状腺组织滤泡结构发生较为严重的破坏，且淋巴细胞浸润比较明显，观察组小鼠血清TgAb、TPOAb水平相比对照组较高，这与既往研究[6]报道一致，提示造模成功。小鼠动情期相当于女性月经周期的分泌期，为了有利于胚胎的顺利植入及着床，动情期的子宫内膜较其他3期明显增厚。本实验通过阴道涂片染色确定动情周期，结果表明观察组小鼠存在动情周期，且节律与对照组无差异，提示动情周期的节律未受其疾病影响而改变。HE染色光镜下观察显示观察组鼠动情期子宫内膜较同期对照组增厚、内膜腺体增大、数量增多。推测机体免疫改变、炎性反应累及子宫内膜。

实验结果显示观察组小鼠galectin-1 mRNA水平低于对照组。同时，观察组小鼠的galectin-1 蛋白的AOD值在动情周期出现了异常表达，动情期低于对照组。galectin-1主要表达在滋养细胞中，属于母胎间相互作用的重要蛋白质之一。其在胎盘植入、子宫螺旋动脉重铸等过程中发挥着至关重要的作用，可通过诱导子宫免疫耐受性树突细胞的扩张，对母胎界面的Th1/Th2免疫平衡产生影响，促进免疫耐受[7-8]。动情期作为妊娠过程关键时期，推测galectin-1 蛋白低表达可能减弱了细胞间识别黏附能力，以及增强诱导T细胞凋亡，促使免疫失衡，不利于妊娠的顺利进行[9-10]。

本研究选取2组小鼠右半侧子宫组织匀浆进行TNF-α、IL-17a水平测定，结果显示观察组小鼠TNF-α、IL-17a水平相比对照组均较低，提示存在免疫反应异常。TNF-α是一种由活化的单核细胞和巨噬细胞产生的细胞因子，除具有抗肿瘤作用外，还能够激活T细胞、促进IL-21、IL-22等细胞因子的产生与分泌，促进炎症及免疫反应。其中Aikawa et al[11]的研究表明，TNF-α已经参与类风湿性关节炎、银屑病、多发性硬化症等自身免疫性疾病的发病过程中。IL-17a是IL-17家族中的重要成员，其可通过募集中性粒细胞、刺激巨噬细胞等多种促炎介质的产生诱导炎症级联反应，并与TNF-α具有协同作用，加强致炎效应，目前已被证实[12]在RA等自身免疫性疾病中高表达，若敲除小鼠IL-17基因后，其自身免疫受到抑制。本研究对于TNF-α、IL-17a水平下降的原因，推测可能与galectin-1表达水平的下降有关。研究[13]表明，galectin-1可以抑制活化T细胞的增殖，促进其凋亡，抑制促炎性细胞因子的分泌并抵抗炎症反应。另有报道[14]显示，galectin-1的敲除可减弱对TNF-α的促增殖作用的抑制。上述提示了本实验中galectin-1蛋白可能通过影响TNF-α、IL-17a两种细胞因子的分泌来调节免疫反应并维持妊娠。

综上所述，桥本甲状腺炎小鼠动情期子宫内膜厚度增加，动情期子宫内膜galectin-1水平较对照组降低，且存在局部免疫反应，从而可能导致子宫内微环境改变，对怀孕产生影响。