电针对PTSD样大鼠学习记忆及海马CA1区Bcl-2/Bax表达的影响

刘倩汝，王 丽，祁 鸣，于 海，张桂青

《精神疾病诊断与统计手册》第五版将创伤后应激障碍(post-traumatic stress disorder, PTSD)描述为以一种或多种方式接触实际的或被威胁的严重暴力或创伤性事件而诱发的一类精神疾病，且常伴有注意力偏离与分离性遗忘[1]。PTSD患者海马体积缩小，神经元有凋亡现象[2-3]，而海马体在记忆存储、定向与提取中扮演重要角色，有研究[4-5]表明，电针对PTSD认知功能损害有效，但作用机制尚未阐明。现欲以单次延长应激(single prolonged stress, SPS)建立的PTSD样大鼠模型为切入点，借助Morris水迷宫、HE染色和Western blot等研究手段，探讨电针对PTSD样大鼠记忆功能及海马CA1区凋亡相关因子Bcl-2/Bax表达的影响，以进一步揭示电针治疗PTSD的分子生物学机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物48只成年清洁级雄性Sprague Dawley大鼠，180～220 g，购自新疆疾病控制动物中心[动物编号：SCXK(新)2019-0032]；饲养环境：室温(24±1) ℃，相对湿度50%～60%，昼夜12 h/12 h交替，保持通风，自由摄食、饮水，动物实验的开展符合本单位医学伦理部门的有关规定。

1.2 主要试剂Anti-Bcl-2兔多克隆抗体、Anti-Bax小鼠单克隆抗体(英国abcam公司，货号ab196495、ab77566)；β-actin内参抗体、HPR标记羊抗兔、羊抗小鼠二抗(英国abcam公司，货号ab205718、ab205719)；苏木精伊红(HE)染色试剂盒(上海歌凡生物技术有限公司，货号M020)。

1.3 模型制备采用SPSS22.0软件将大鼠随机等分为正常对照组、模型组、电针组和电针对照组，依据课题组前期造模方法[6]，对模型组和电针组大鼠做如下处理：① 禁锢2 h；② 强迫性游泳20 min，其中水深35 cm，水温25 ℃，休息15 min；③ 99.5%的无水乙醚麻醉箱中麻醉至意识丧失，不能站立，后立即取出。电针组和电针对照组在造模6 h内，参照相关文献[7-8]，将大鼠固定在支架上，取“百会”、“大椎”和“足三里”，沿皮下缓慢进针，深度为5 mm，连接电针仪，疏密波，频率为5～10次/s，至大鼠肌肉轻微震颤为宜，每次15 min，持续14 d。

1.4 模型评估分别通过旷场实验和Morris水迷宫实验测试4组大鼠的情绪唤醒水平和学习记忆能力。① 旷场实验：自制旷场实验箱，规格为900 mm×900 mm×500 mm，底部为16个等大小方格，上方与红外摄像仪相连，数据采集时间为5 min，记录参数为大鼠在旷场中的直立次数与跨格次数；② Morris水迷宫实验：前5 d为定位航行能力测试，将大鼠面向迷宫内壁置入池内，若60 s内大鼠找到水中站台并停留5 s，则同步的计算机停止跟踪，若找不到，则引导大鼠登到水中站台，并停留10 s，使其充分感受周围的空间位置信息，重复4次，记录平均上台潜伏期。第6天为空间探索能力测试，移除水下站台，将大鼠从第2、3和4象限(非站台所在象限)的任意一个方位面壁置入池内1次，记录其穿台潜伏期(即穿过原站台所在位置所需时间)和穿台次数。

1.5 海马组织提取与HE染色完成模型评估后采用3%水合氯醛30 mg/kg对4组大鼠行腹腔麻醉，暴露胸腔，剪开右心耳开始放血，随后向大鼠心脏以50 ml/min的速度推注生理盐水灌洗液，直至从右心耳流出的液体变得清亮，后迅速断头取脑，在冰上采用玻璃分针剥离双侧海马组织，一侧在液氮罐中保存24 h后于-80 ℃冰箱封存待用，另一侧经10%甲醛溶液固定30 min后行50%、70%、80%、95%和100%梯度酒精脱水，后在二甲苯中进行透明化处理，经浸蜡、包埋、切片、脱蜡与染色、漂洗、复染和封藏等一系列常规处理后，制作组织切片。光学显微镜下观察各组大鼠海马CA1组织形态特点。

1.6 Western blot法检测Bcl-2/Bax蛋白表达取先前冻存的海马组织100 mg，用眼科剪剪碎，置于含1% PMSF的预冷RIPA裂解液中，充分裂解30 min，于匀浆器中匀浆，15 000 r/min离心15 min，取上清液，后稀释、孵育，利用吸光度(optical density, OD)值测定样本蛋白浓度，煮沸冷却备用；配备5%的浓缩胶和10%的分离胶，恒压100 V电泳90 min，后将蛋白转膜至PVDF膜上(恒压80 V、60 min)，PBST洗膜8 min×3次，5%脱脂牛奶封闭2 h，敷一抗(Bcl-2及Bax，1 ∶ 800，β-actin，1 ∶ 1 000)，于4 ℃冰箱过夜，PBST洗膜10 min×3次、8 min×5次，敷二抗(HPR标记羊抗兔，稀释比例为1 ∶ 5 000)2 h，PBST洗膜5 min×4次、10 min×3次，暗室中采用ECL化学发光法曝光显色，用BandScan软件得出胶片灰度值。

2 结果

2.1 旷场实验站立与跨格次数比较与正常对照组比较，模型组大鼠站立次数与跨格次数均减少；与模型组比较，电针组大鼠站立与跨格次数均增多，差异有统计学意义(P<0.05)，其中正常对照组和电针对照组大鼠两项指标比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1 旷场实验各组大鼠站立与跨格次数比较

1: 正常对照组; 2: 模型组; 3:电针组; 4: 电针对照组; 与正常对照组比较:*P<0. 05；与模型组比较：#P<0.05

2.2 Morris水迷宫实验在定位航行能力测试阶段，前2 d各组大鼠平均上台潜伏期差异无统计学意义(P>0.05)，第3天开始，与正常对照组比较，模型组大鼠平均上台潜伏期延长；与模型组比较，电针组大鼠平均上台潜伏期缩短，差异均有统计学意义(P<0.05)。在空间探索能力测试阶段，移除水下20 mm处的站台，与正常对照组比较，模型组大鼠穿台潜伏期延长，穿台次数减少；与模型组比较，电针组大鼠台潜伏期缩短，穿台次数增多，差异均有统计学意义(P<0.05)，其中正常对照组和电针对照组大鼠以上指标比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3 海马组织HE染色结果与正常对照组比较，模型组大鼠海马组织CA1区海马经元排列紊乱，结构异常，且胞核和胞质界限较模糊，与模型组大鼠比较，电针组大鼠海马组织CA1区神经元排列较整齐，结构趋于正常，正常对照组和电针对照组大鼠海马组织CA1区神经元形态结构比较未见明显差异。见图2。

2.4 大鼠海马组织CA1区Bcl-2/Bax蛋白表达各组大鼠海马组织CA1区Bcl-2/Bax蛋白表达存在差异(F=154.50,P<0.05;F=42.67,P<0.05)。与正常对照组(0.345±0.034；0.193±0.031)比较，模型组(0.606±0.049；0.325±0.054)大鼠海马组织CA1区Bcl-2/Bax蛋白表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，电针组(0.364±0.034；0.175±0.035)大鼠海马组织CA1区Bcl-2/Bax蛋白表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)，正常对照组和电针对照组(0.321±0.027；0.165±0.034)大鼠海马组织CA1区Bcl-2/Bax蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

表1 Morris水迷宫实验大鼠上台潜伏期、穿台潜伏期和穿台次数的比较

与正常对照组比较:*P<0.05；与模型组比较：#P<0.05

图2 各组大鼠海马组织CA1区HE染色×400

A: 正常对照组; B: 模型组; C:电针组; D: 电针对照组

3 讨论

近年来随着对PTSD研究的深入，除了典型的三大核心症状，即与创伤事件有关的侵入性记忆、持续回避与创伤事件有关的内容和与创伤事件有关的警觉性或反应性明显改变，人们开始更加关注创伤暴露者认知和心境方面的负性改变[1]，记忆力是认知功能的核心，而动物模型的引入为人们研究PTSD记忆力减退的发病机制提供了可能。中医认为，脑为元神之府，是调节人们精气神、认知、情绪情感和意志过程的集大成者，人体阳气蒸腾上行，填濡髓海，督脉循行于后背正中线，与六条阳经均有交汇，百会位居大脑巅顶，可升阳益气，醒脑宁神，为督脉要穴，大椎为督脉、手、足三阳脉交会穴，可调脏腑机能，足三里可补益气血，治疗下肢痿痹，百会、大椎和足三里三穴的贯通与配合有滋养血脉，提升心智的功效。

1: 正常对照组; 2: 模型组; 3: 电针组; 4: 电针对照组; 与正常对照组比较:*P<0.05；与模型组比较：#P<0.05

旷场实验是测试实验动物情绪唤醒水平和自主运动的经典行为学实验[9]，模型建立及电针干预后，与正常对照组比较，模型组大鼠在旷场中站立与跨格次数均减少，行为显呆滞、刻板；与模型组比较，电针组大鼠站立与跨格次数均增多，行为显主动、活跃，情绪唤醒水平增强，对周围事物的兴趣增加。积极的行为活动可提升个体的内在自我认知[10]，进而影响其对周围信息的判断和评价，Morris水迷宫实验可通过定位航行和空间探索两个方面对实验动物的学习记忆能力进行评估[11]，从第3天开始，与模型组组比较，电针组和正常对照组大鼠平均上台潜伏期缩短，定位航行能力明显提升；在第6天的空间探索阶段，撤去水下站台后，与模型组比较，电针组和正常对照组大鼠多次穿过水下站台且穿台时间很短，对水下站台位置的感知能力明显更强，这与李艳鸣 等[12]研究结果类似，电针治疗提升了PTSD模型大鼠的学习记忆表现。

徐爱军 等[13]研究表明，SD大鼠接受SPS应激后，学习记忆能力减退，海马神经元凋亡相关因子Bcl-2/Bax表达均上调，未行干预治疗。在本次研究中，在行为学检测后，以对创伤应激最为敏感的大鼠海马组织CA1区为切入点，HE染色结果显示，模型组大鼠海马经元排列紊乱，结构异常，且胞核和胞质界限较模糊；电针组大鼠海马组织CA1区神经元排列较模型组更整齐，结构已趋于正常，这或许可以从形态学的角度解释PTSD样大鼠认知记忆能力减退的原因。细胞凋亡包括诱导、调控和效应3个步骤和线粒体、死亡受体和内质网等3个主要途径，其中以线粒体依赖途径最为重要，Bcl-2基因为优秀的抗凋亡基因代表，对促凋亡因子Bax有着直接的拮抗作用，Bcl-2/Bax蛋白均在线粒体上游，能有效调控凋亡启动因子cyt-c的释放，进而激活重要的凋亡执行者caspase-3，从而介导细胞的存活或死亡[14]。Western blot结果显示，与正常对照组比较，模型组大鼠海马组织CA1区Bcl-2/Bax蛋白表达均升高，与模型组比较，电针组Bcl-2/Bax蛋白表达均降低，表达量恢复正常，电针治疗可改善PTSD样大鼠的学习记忆能力，可能与下调海马组织CA1区Bcl-2/Bax蛋白表达有关。值得注意的是，在上述几个方面，正常对照组和电针对照组均未表现出明显差异，表明对于正常健康SD大鼠而言，电针治疗不会对其情绪唤醒以及行为变现产生干扰，全部选用雄性大鼠，旨在避免雌性动物体内周期性激素水平变化对实验的影响。