神经妥乐平对阿尔茨海默病大鼠自噬的影响

赵仲艳，刘 涛，赵二义，黄仕雄，徐志育

阿尔茨海默病(alzheimer disease，AD)是一种进行性发展的神经系统退行性疾病，其发病机制尚不清楚，临床治疗主要以控制精神症状、改善患者认知功能为主[1]。建立相应的动物模型来研究其发病机制，寻找更有效的药物对于AD的治疗具有重要意义。神经妥乐平(neurotropin，NTP)是牛痘疫苗接种家兔后，从其炎症皮肤中提取的一种小分子活性物质[2]。NTP可以调节机体的免疫系统、神经系统等，具有神经修复、抗感染、镇痛等作用，临床常用于腰痛症、肩周炎、变形性关节炎等的治疗[3]。近年来，研究[4]显示，NTP可以调节机体的信号通路，保护神经元损伤。因此，该研究建立AD体外模型，旨在分析NTP对AD大鼠的作用及其具体作用机制，为新药物的开发提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 动物、仪器与试剂SPF级SD雄性大鼠45只，体质量220～250 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号SCXK(京)2017-0022，饲养于本院动物中心实验室，保持室温恒定为25 ℃，模拟昼夜，自由摄食与饮水。HT-7700透射电镜购自日本日立公司；NTP购自日本Nippon Zoki Pharmaceutical，注册证号 S20140085；β淀粉样蛋白(Aβ1-42)购自美国Sigma公司；TUNEL检测试剂盒购自上海秉新生物科技有限公司；Notch1、NICD、Hes5、Caspase-3、Bcl-2、Bax、Beclin1、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ单克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司；β-actin和辣根过氧化酶(HRP)标记羊抗兔IgG购自DAKO公司。

1.2 动物造模及给药大鼠预饲养1周后，随机均分为对照组、模型组和NTP组。模型组和NTP组每日上午腹腔注射D-半乳糖(100 mg/kg)[5]，6周后，模型组和NTP组麻醉后，海马区缓慢注入5 μl β淀粉样蛋白(Aβ1-42)，对照组注射等体积生理盐水。若造模后大鼠出现反应迟钝、动作迟缓等，则为造模成功[6]。造模后，NTP组腹腔注射1 ml NTP溶液(1.2 Nu/kg)；模型组和对照组腹腔注射等体积生理盐水，连续治疗2周。于治疗后处死大鼠，迅速断头取脑，无菌取大鼠海马组织。

1.3 各组大鼠行为学测试及脑组织病理学检查造模前，将大鼠放入温水中自由游泳5 min，熟悉水迷宫[6]。于术后第10 天至术后第14 天采用Morris水迷宫测试各组大鼠的行为学。定位航行实验：将大鼠从一个象限轻放入水，若120 s内大鼠能找到平台，记录其时间为逃避潜伏期，若120 s后仍未找到，则逃避潜伏期为120 s，连续试验4 d。空间探索实验：实验第5天将平台拿走，将大鼠从一个象限轻放入水，记录120 s内大鼠在原平台象限停留的时间及占总路程的百分比。

1.4 各组大鼠脑组织病理学检查取大鼠海马组织，采用4%多聚甲醛固定，进行常规切片制作，进行HE染色，在光镜下观察组织的病理变化，每张切片随机取5个视野拍照。

1.5 各组海马组织CA1区神经元凋亡的观察取大鼠海马组织，采用4%多聚甲醛固定，进行常规切片，采用TUNEL法进行染色，严格按照试剂盒说明操作，于荧光显微镜下观察细胞凋亡情况，根据阳性细胞数与总细胞数，计算出细胞凋亡率。采用Western blot测定组织中Caspase-3、Bax和Bcl-2的表达量。

1.6 各组海马组织CA1区神经元自噬的观察取大鼠海马组织，采用2.5%戊二醛和2%多聚甲醛的磷酸缓冲液的混合固定液固定，梯度酒精脱水、浸泡、包埋，醋酸铀-枸橼酸铅双染色，电镜下观察。采用Western blot测定组织中Beclin1、LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ的表达量。

1.7 Western blot检测海马组织Notch信号通路的表达取海马区脑组织，匀浆，使用细胞裂解液严格按照蛋白裂解步骤提取总蛋白，采用BCA法进行蛋白定量，取50 ng总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，电转膜至PVDF膜，室温密封2 h，采用洗膜缓冲液洗膜并加一抗(稀释比例均为1 ∶ 1 000)4 ℃孵育过夜，洗膜加二抗(稀释比例均为1 ∶ 5 000)室温孵育2 h。再用ECL化学发光显示，选用β-actin作为内参，凝胶图像处理系统分析对比条带强弱。

2 结果

2.1 NTP对AD大鼠学习记忆能力的影响Morris水迷宫试验结果显示：与对照组比较，模型组和NTP组大鼠逃避潜伏期在第2、3 和4 天明显增加(P<0.05)，第5天在原象限停留的时间比和路程比明显降低(P<0.05)；与模型组比较，NTP组大鼠逃避潜伏期在第2、3和4天明显降低(P<0.05)，第5天在原象限停留的时间比和路程比明显升高(P<0.05)。见图1。

2.2 NTP对AD大鼠海马CA1组织病理变化的影响HE染色结果显示，对照组大鼠海马组织细胞结构完整，神经元细胞形态正常；模型组大鼠海马组织大量细胞出现核固缩呈三角形，胞质嗜伊红，正常细胞数减少；NTP组大鼠海马组织细胞形态趋于正常，仅见少量核固缩的细胞。见图2。

2.3 NTP对AD大鼠海马CA1组织凋亡的影响TUNEL结果显示，与对照组比较，模型组和NTP组海马组织细胞的凋亡率明显升高(P<0.05)；与模型组比较，NTP组海马组织细胞的凋亡率明显降低(P<0.05)。Western blot实验显示，与对照组比较，模型组和NTP组海马组织Caspase-3、Bax蛋白的表达明显上调(P<0.05)，Bcl-2蛋白的表达明显下调(P<0.05)；与模型组比较，NTP组海马组织Caspase-3、Bax蛋白的表达明显下调(P<0.05)，Bcl-2蛋白的表达明显上调(P<0.05)。见图3。

图1 NTP对AD大鼠学习记忆能力的影响

A： Morris水迷宫定位航行实验统计结果；B：水迷宫空间探索实验统计结果；a：对照组；b：模型组；c：NTP组；与对照组比较：*P<0.05；与模型组比较：#P<0.05

图2 NTP对AD大鼠海马组织形态学影响 HE×400

A：对照组；B：模型组；C：NTP组

图3 NTP对AD大鼠海马组织凋亡的影响

A：TUNEL染色检测AD大鼠海马组织的凋亡×400；B：Western blot检测蛋白的表达；a：对照组；b：模型组；c：NTP组；与对照组比较：*P<0.05；与模型组比较：#P<0.05

图4 NTP对AD大鼠海马CA1组织自噬的影响

A：电镜检测AD大鼠海马组织的自噬，箭头所指为凋亡小体×20 000；B：Western blot检测蛋白的表达；a：对照组；b：模型组；c：NTP组；与对照组比较：*P<0.05；与模型组比较：#P<0.05

2.4 NTP对AD大鼠海马CA1组织自噬的影响电镜显示，对照组大鼠海马组织细胞结果完整，偶见个别的自噬体；模型组大鼠海马组织的自噬体数量明显增多；NTP组大鼠海马组织的自噬体数量明显减少。Western blot实验显示，与对照组比较，模型组海马组织Beclin-1蛋白的表达明显下调，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例明显上调(P<0.05)；与模型组比较，NTP组海马组织Beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例均明显上调(P<0.05)。见图4。

2.5 NTP对AD大鼠海马组织Notch信号通路表达的影响与对照组比较，模型组和NTP组大鼠Notch1、NICD和Hes5蛋白的表达明显下调(P<0.05)；与模型组比较，NTP组大鼠Notch1、NICD和Hes5蛋白的表达明显上调(P<0.05)。见图5。

3 讨论

AD是一种神经系统退行性疾病，腹腔注射D-半乳糖注射造模是一种最为简便有效的方式，海马区注射Aβ多肽是模拟AD病理损害的一种重要的方法[7]。因此，本研究采用腹腔注射D-半乳糖联合海马区注射Aβ1-42建立大鼠AD模型。NTP干预可以显著缩短AD大鼠在Morris水迷宫试验中延长的逃避潜伏期。Morris水迷宫是常用的评估动物学习记忆能力的实验，包括陈述性记忆和空间参考记忆两个方面，提示NTP干预可以显著改善AD大鼠降低的学习记忆能力。本研究中，NTP干预可以明显改善AD大鼠海马组织的病理损伤。李波 等[8]的研究显示，NTP可以调节中枢神经系统，对于脑缺血、脑水肿、神经痛等具有良好的临床疗效，提示NTP可能通过调节机体的信号通路，改善AD大鼠的学习记忆障碍，减轻脑组织损伤。

本研究中，AD大鼠海马组织的溶酶体和自噬体数量明显增加，经NTP干预后溶酶体和自噬体数量明显减少。临床研究[9]显示，AD患者存在异常增强的自噬作用，可以参与Aβ的产生、转运和清除，参与AD的发生发展，本研究结果与之基本一致，提示NTP可能通过调节自噬，减轻AD的病理损伤。本研究中，NTP干预可以下调AD大鼠海马组织中降低的Beclin1水平，上调LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例。LC3是一种典型的自噬体标志物，在自噬状态下，LC3-Ⅰ会转变为一种膜结合形式即LC3-Ⅱ，临床常用LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值来衡量自噬活性；Beclin1是一个参与自噬和调控自噬的关键基因，与自噬吞噬小泡的形成初期有关[10]。Pomilio et al[11]的研究显示，早期诱导自噬可以加快病理蛋白的清除，减轻Aβ的神经毒性，本研究结果与之基本一致，提示NTP可能通过诱导自噬，加快Aβ的清除，减轻AD大鼠的病理损伤。本研究中，NTP干预可以明显下调凋亡蛋白Caspase-3和Bax的表达，上调Bcl-2的表达，降低AD大鼠升高的细胞凋亡率。Zhang et al[12]的研究显示，Beclin-1是可以与Bcl-2等抗凋亡蛋白结合，抑制其抗凋亡作用，本研究结果与之基本一致，提示NTP可能通过调节机体的自噬作用，抑制神经元细胞凋亡，保护脑组织损伤。

Notch信号通路是一种高度保守的信号通路，广泛的存在于脊椎动物和非脊椎动物中，可以参与多种中枢神经系统疾病的发生发展，包括AD、脑缺血损伤等。本研究中，AD大鼠海马组织中Notch1、NICD和Hes5蛋白的表达显著下调，经NTP干预后，表达明显上调。Notch 1是一种单次跨膜受体，与相邻配体结合可以活化γ-分泌酶，促进NICD的释放并与核内的转录因子结合，增强下游靶基因Hes的表达，Hes5是Notch1信号通路的关键靶基因，可以参与调控多个细胞的发育、增殖、凋亡等[13]。Kong et al[14]的研究显示，AD患者的海马组织中Notch1的表达水平显著高于正常组，其机制可能与β淀粉样前体蛋白、早老素等有关，本研究结果与之有所差异，可能是由于本研究采用Aβ1-42建立大鼠AD模型，抑制Notch1的表达，引起神经退行性变化。张丽 等[15]的研究显示，Aβ可以抑制Notch1的表达，抑制神经干细胞的增殖分化，本研究结果与之基本一致，提示NTP干预可能通过激活Notch信号通路，促进神经干细胞分化，提高AD大鼠的学习记忆能力。

图5 各组大鼠海马组织Notch信号通路的表达

a：对照组；b：模型组；c：NTP组；与对照组比较：*P<0.05；与模型组比较：#P<0.05