不同基因型慢性乙肝患者的耐药变异位点分析

李淑悦，程 娜，王嘉鑫，肖金平

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染仍然是一个重要的公共卫生问题，全世界每年大约有超过78万人死于乙肝相关性疾病(如肝硬化、原发性肝细胞癌)[1]。HBV病毒感染的特点是感染率高、感染人数众多、病程长，目前缺乏特效药物且难以完全治愈。大面积乙肝疫苗的普及，已经使HBV感染率明显下降[2]，现在人们开始关注耐药和彻底清除乙肝病毒问题。近几十年来，HBV感染的治疗药物主要依赖于干扰素和核苷(酸)类似物(nucleoside/nudeotide analogues，NAs)这两大类，NAs具有很强的抑制病毒复制作用，比基于干扰素的疗法更方便并且具有更少的副作用，然而长期用药后，一些药物会出现病毒学突破现象。现拟使用直接测序法对江西省104例样本的逆转录区(RT区)行耐药变异位点检测，区分基因型、筛选正选择位点，进一步分析该地区慢性乙肝患者耐药相关原因，为患者个体化医疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病例资料选择2015～2018年间在南昌大学第一附属医院门诊定期随访的慢性乙型病毒性肝炎患者，共计104例。患者均来自江西省本地区市、县，所有诊断符合《慢性乙型肝炎诊断标准(2015年版)》[3]。排除HCV、HDV、HIV混合感染，排除酒精性肝病、脂肪肝及自身免疫性肝炎患者。其中男77例，女27例，年龄21～75(43.36±12.47)岁。所有患者均接受了NAs抗病毒治疗，疗程≥1年。患者每1～6个月行血清HBV DNA、肝功能检测。研究设计经南昌大学第一附属医院伦理委员会审核并通过。

1.2 实验室指标实验室检测指标包括乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、HBV DNA水平。

1.3 应答不佳界定抗病毒治疗24周，HBV DNA较基线下降幅度>1 log10IU/ml，但仍然可以检测到[3]。

1.4 HBV DNA RT区测序根据HBV DNA P基因RT区的保守序列，应用Primer Premire 5.0软件自行设计引物，引物由武汉康圣达医学检验所合成，序列为：外侧正向引物ESP：5′-AGGCCTTATAAGTTGGCGA-3′，反向引物EAP：5′-TCCTGCTCAAGGAACCTCTA-3′；内侧正向引物ISP：5′-CY(T/C)TGTATTCCCATCCCATC-3′，反向引物IAP：5′-TGACATACTTTCCAATCA ATAGG-3′，包含大部分目前已知的HBV RT区核苷酸类似物耐药变异位点，并利用上述引物构建PCR反应体系对目的片段扩增。PCR 扩增阳性产物由武汉康圣达医学检验所直接测序。

1.5 基因变异检测临床样本测序结果以NCBI Genotyping 工具中23株基因型为A-H型的HBV全基因组标准序列为参照(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi)来确定基因分型。采用BioEdit软件包(版本7.0.5)进行核酸与氨基酸序列的比对，分析氨基酸的变异。

1.6 选择压力分析非同义突变和同义突变的率比ω(ω=dN/dS)是反应选择压力的重要指标。当ω>1时，表明该位点受到正选择压力作用，同时该密码子被称为正选择位点；ω=1或ω<1则分别说明该位点受到中性选择和纯化选择(即负选择)[4]。采用DataMonkey在线软件(http://www.datamonkey.org/)筛选正选择位点，Datamonkey由HyPhy执行，HyPhy是一种分子进化分析平台，在计算机集群上进行并行分析，简化且易于使用[5]。Datamonkey筛选正选择位点的算法主要包括随机效应似然模型(random effects likelihood model，REL)、固定效应似然模型(fixed effects likelihood model，FEL)和单一似然祖先计数法(single likelihood ancestor counting，SLAC)[6]。SLAC是运行速度最快、同时也是最保守的算法,适用于分析大型数据集(50～150条序列)，能够重建每个密码子位点的替代过程，存在错漏选择位点的可能，但亦能防止将中性位点误判为正选择位点。FEL在统计性能和计算工作量之间保持有良好平衡，总体表现属最佳算法，适用于分析中型或者大型数据集(50～100条序列)，也能重建密码子的替代过程。REL是PAML软件中基于密码子进行选择分析这一算法的扩展，它允许同义替代率存有差异，因而REL常常是能从小型或者低度分化的序列比对结果中检测出选择作用的唯一方法，适用于小型数据集(5～15条序列，至多40条)。然而，由于此法所依赖的假设条件较多，也容易产生假阳性。从各方法的适应条件以及出现假阳性和假阴性结果等方面综合考虑，本研究采用FEL方法筛选正选择位点(P<0.1)。

2 结果

2.1 挽救治疗的疗效分析104例患者中B基因型患者为93例， C基因型患者为11例，未检测出其他基因型。在两种不同基因型中性别和年龄方面均无差异(P>0.05)。挽救治疗后患者HBV DNA、ALT水平均下降，HBV DNA水平降低更加明显。但e抗原阴转率、HBV DNA及ALT水平在不同基因型中的无差异(P>0.05)(表1)。

2.2 HBV RT区主要变异类型及在不同基因型中的分布B基因型和C基因型患者在性别、年龄、耐药率、HBeAg阳性率、用药类型方面无差异(表2)。104例患者中87例检测出与药物相关变异位点，其中14例(13.46%)出现多位点耐药变异(3个及以上位点)；剩余17例中7例未检出耐药变异位点。M204I位点变异率最高，以B基因型为主； M204I+L180M位点变异在C基因型中发生率高于B基因型，差异有统计学意义(P<0.05)(表3)。

表1 B基因型及C基因型患者的人口学及临床特征 [M(P25，P75 )]

表2 B基因型及C基因型患者人口学及临床特征

表3 B基因型及C基因型患者耐药变异类型[n(%)]

2.3 选择压力的分析两种基因型的选择压力均以中性选择为主，但B基因型中可见正选择位点(表4)。利用在线DataMonkey软件，以ω值(dN/dS)>1且P<0.1时为正选择点筛选出B基因型中rt207、rt229 为正选择位点, rt169、rt245为负选择位点；C基因型中只发现rt202、rt204、rt245为负选择位点(表5、6)。

表4 不同基因型的选择压力分析(n)

表5 B基因型序列的选择位点

LRT:似然比检验

表6 C基因型序列的选择位点

3 讨论

HBV是一个部分闭合的环状双链DNA病毒，HBV在复制过程中依赖逆转录酶产生的前基因组RNA完成，而逆转录酶缺乏校正活性，故是一种具有高变异性的DNA病毒[7-8]。近年来，慢性乙型肝炎的治疗取得了实质性进展，以服用NAs为主，但无限期治疗会增加耐药性发展的风险，在药物和人体免疫环境双重诱导下，HBV RT区出现了位点突变[9]。目前LAM、LDT出现高耐药率，慢性乙型肝炎诊疗指南明确指出可加用ADV,或改用ETV、TDF，随着各种NAs的广泛使用，研究[10]表明ETV、ADV、TDF也出现耐药现象。本研究中104例定期随访患者出现耐药后多选用ETV或TDF进行挽救，都表现出良好疗效。在不同基因型中，e抗原阴转率、ALT复常率、e抗原阳性率、耐药率、用药类型方面均无差异，但耐药变异位点A181V+N236T、M204V+L180M+I169T/L+S202G、M204V+L180M+T184A+I169T/L、M204V+L180M+S202G、M204V+L180M+M250L、N236T、S/C256G、S213T、L217F、Q215H、Y/F221H只在B基因型中检测到,而M204I+A181T、M204V+L180M+T184I+V137、M204V/I+L180M +V137L只在C基因型中检测到；M204I+L180M位点变异率在C基因型中高于B基因型，差异有统计学意义，提示HBV RT区位点突变是多因素综合影响的结果，在临床工作中基因分型及RT区测序应联合应用。

慢性乙肝患者在接受NAs药物后，来自病毒变异体之间的竞争(复制效率的差异)和/或宿主免疫活性的选择压力，使含有耐药突变的变异株逐渐发展成为优势株，最终导致HBV群耐药[11-13]。病毒基因突变符合达尔文进化理论——适者生存。对单一的一种抗病毒药物而言，病毒群体所面临的就是一个针对特定靶点的具有高度特异性的选择压力，当一个基因受到正选择作用，说明其群体为了适应新的环境，需要提供有利的突变，产生新的基因功能；而当一个基因受到负选择作用即此基因保持原有的功能且趋于稳定[14]。正选择位点筛选是研究病毒基因序列进化分析的一个重要方法。RT区是相对保守区，以负选择作用为主，在本研究中B基因型患者筛选出正选择位点rt207、rt229，这两种基因位点并不包含在常见的耐药位点中，说明江西省内核苷酸类似物的广范使用，促使新的基因功能出现，并亦可能是出现多个新耐药位点的原因，但这两个突变位点与哪种药物耐药相关尚未明确，有待进一步研究。