神经元细胞与嗅鞘细胞体外共培养后的生物学特性研究

吴一民，李瑞峰，吕惠成，于宝龙，李文选，张沛

(内蒙古医科大学第二附属医院 骨科，内蒙古 呼和浩特)

0 引言

嗅鞘细胞可以通过分泌神经营养因子来改善了脊髓损伤后的微环境，营养和支持神经元细胞，在神经元细胞的再生修复中具有诱导分化以及促进神经元细胞增殖和再生等作用。本研究建立嗅鞘细胞与神经元细胞的非接触共培养体系，研究嗅鞘细胞促进神经元细胞生长、增殖的潜能与条件，找到介导神经营养因子信号转导的具体通路，为脊髓损伤的治疗提供新的理论基础及临床治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物与细胞

实验动物：清洁级新生SD 大鼠10 只，体重2kg，由内蒙古大学动物饲养中心提供 。

实验细胞：神经元细胞购自美国ScienCell 公司。嗅鞘细胞及成纤维细胞均在实验室培养。

1.2 主要试剂与仪器

CO2细胞培养箱(美国Thermo 公司)，OLYMPUS BXDX 光学显微镜及显微照相系统(日本OLYMPUS 公司)，倒置相差显微镜(德国Leica 公司)。

细胞培养器械：Sigma 显微外科手术器械、解剖显微镜、超净工作台、25cm 塑料培养瓶(NUNC 公司)；针头式滤器(美国Gelman 公司)。

Transwell 细胞共培养系统(美国Corning 公司)、DMEM 培养基、胎牛血清(FCS)购自Gibico 公司、多聚赖氨酸(PLL) 、MTT、DMSO 购自sigma 公司、 GFAPIgG、P75 IgG (Santa Cruz 公司)。

1.3 嗅鞘细胞与成纤维细胞的分离、培养和纯化

取出生后5d 的SD 大鼠，麻醉后于无菌条件下取材，D-Hanks液漂洗后剪成糊状，移入离心管中，加入0.125%胰蛋白酶消化，于37℃培养箱，作用25min，用含20%FCS 的DMEM/F12 培养基作用8min 终止消化，于800rpm 离心5min 去除上清液，再加入无血清的DMEM/F12 培养基清洗一次，最后用含20%的FCS 的DMEM/F12 培养基将其制成单细胞悬液，用火焰抛光后的Pasteur移液管反复吹打置悬在超净工作台内，以1×106/mL 的密度将细胞悬液接种在经Poly-L-lysine 处理过的培养瓶中，于37℃、5%CO2培养箱中培养，3d 后半量换液1 次，再培养2d 用10%FCS的培养基进行换液。1-2d 后进行纯化。

在培养好的嗅鞘细胞中加入Ara-C 作用36h，作用浓度3umol/L，用DF12 轻 洗2 遍，换10%FCS-DF12 液 培 养3d 后，D-Hanks 液 洗2 次，0.125%的 胰 酶+0.02%EDTA 消 化3-5min，消化时，在倒置相差显微镜下观察，待细胞突起回缩、胞体变圆，立刻加入纯血清终止，其血清终浓度为20%，作用5min。细胞悬液于800rpm 离心5min，弃上清，用条件培养液(10%FCS+20μmol/L Forskolin+20μg/mL 的BPE+ DF12)置悬细胞制成单细胞悬液，接种培养瓶中，37°C、5%的CO2 培养箱中继续培养，30min 后，将培养上清连同未贴壁细胞进行转种。再过30min 重复上一步骤。24h 后将含未贴壁细胞的培养液移入15mL 离心管中，取20ul 细胞悬液用台盼蓝染色后计数活细胞，用10%FCS-DF12 将纯化后的嗅鞘细胞密度调整为1×106/mL 接种于PLL 预处理盖玻片的6孔培养板中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养备用。

成纤维细胞按照常规方法培养后备用。

1.4 共培养体系的建立

实验设计：嗅鞘细胞和神经元细胞共培养组(实验组)、成纤维细胞与神经元细胞共培养组(对照组)。

共培养体系的建立：将第3 代神经元细胞接种于Transwell 培养板底层，24 小时后，在培养板上层装入小室，同时将第3 代嗅鞘细胞或成纤维细胞接种在小室底部，接种浓度均为1×103个/mL。补足培养液，使培养液完全覆盖上层小室中的细胞。Transwell 培养板小室底部的聚碳酸酯膜，可使细胞贴壁生长，由于膜孔径只有0.4μm，小室中的细胞无法通过，而培养液、细胞生长因子以及小分子物质可流通。

1.5 观测指标

细胞形态观察：通过Olympus 倒置显微镜动态观察不同实验组神经元细胞的形态及生长情况的变化。

细胞生长曲线测定：取生长良好的细胞消化制备单细胞悬液，计数，调整细胞浓度为1×105/mL，接种于30 个100mm 培养皿中，每皿接种2mL，置于CO2孵箱进行培养，每日取出三个培养皿，0.25%胰酶消化，计算每个培养皿中的细胞数，取均值。连续观察10 天，以时间为横坐标，细胞数为纵坐标，绘制生长曲线。

细胞代谢活性测定：于细胞培养第6 天后将2 组共培养系统中的神经元细胞消化，制备成细胞悬液，加入到96 孔板中，每孔100μL，细胞数在105个左右，孔板加好后，加盖取出无菌操作台，在显微镜下观察后在待测细胞中每孔加浓度为2g/L 的MTT30mL，37℃下孵育6 及12小时后取出，平板离心机离心后吸去上清，每孔加入100mL 的DMSO，振荡器上震荡5min，在酶标仪490nm 波长处测定吸光度(OD)值。

1.6 统计学分析

应用SPSS 统计软件分析数据，组间比较用t 检验，P＜0.05 具有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞形态

在倒置显微镜下可见刚接种的两组神经元细胞呈圆形或者椭圆形。48 小时后，两组细胞均可见细胞贴壁生长，外观呈梭形或三角形，细胞间突起有相互交织。培养的第4 天，实验组细胞数量迅速增长，细胞体积增大，细胞呈三角形或多角形，细胞间交织成网状；对照组细胞数量有一定增长，细胞体积稍增大，多数细胞呈梭形，细胞间部分交织成网状。第8 天两组数量生长均变缓慢，逐步形成细胞集落，细胞呈片状。

图1 实验组和对照组神经元细胞形态学观察

2.2 细胞生长曲线

细胞传代后第1～3 日为潜伏适应期，两组细胞均缓慢生长，细胞数目逐步增加。

实验组4日后细胞数开始逐步增加，第5～6日开始迅速增加，尤以第6日增加明显，7日继续增加，但增幅减慢，8日后趋于稳定，达到平台期。

对照组4 日后细胞数略有增加，第5～6 日细胞数开始明显增加，第7 日继续增加，但增幅减慢，8 日后趋于稳定，达到平台期。

2.3 细胞代谢活性测定

有代谢活性的细胞中加入MTT 培养4h 后，细胞质内开始出现蓝色结晶体，不同时段的细胞胞质内均可以观察到浓度不同的蓝色结晶。实验组与对照组比色后的OD 值(表1)，经统计学分析差异有统计学意义(P＜0.01)。

表1 各组MTT 实验测定值 n=48)

表1 各组MTT 实验测定值 n=48)

时间(h) 实验组 对照组 t 值 P 6 0.37±0.02 0.28±0.03 2.51 ＜0.01 12 0.39±0.03 0.16±0.01 3.29 ＜0.01

3 讨论

嗅鞘细胞是一种神经支持细胞，其膜上表达出很多与细胞粘合和轴突生长相关的分子，为再生神经建立了很好的内环境。研究证实，嗅鞘细胞可以分泌多种神经营养因子，这些神经生长因子可以保护残存的神经元，改善脊髓损伤后神经元周围的微环境，逐步修复脊髓损伤。

神经营养因子是一种大分子的蛋白质，该蛋白质主要产生在神经元细胞当中，小部分产生在与神经相关的细胞中，如嗅鞘细胞、神经胶质细胞和雪旺氏细胞等。近年来，也有研究发现一些神经营养因子也可由神经元产生，经轴浆顺向运输到达神经末梢，进而可调控突触后神经元细胞的形态和功能完整性[1]。神经营养因子的作用体现在通过与受体结合，经过轴浆的逆向运输到达胞体，调节有关蛋白质的合成，对神经元细胞的生长、增殖以及部分功能的发挥起一定作用[2-3]。它的受体主要分为两种表现形式，其中一种主要表现为较高的亲和力(trk)，另外一种表现为较低的亲和力(P75NGFR)，这两种不同亲和力的受体都可以使神经细胞突起向NTFs 浓度高的方向生长，从而使神经细胞得到营养作用[4]。神经营养因子的主要作用方式是首先与这两种受体结合，使细胞的信号(有关增殖和凋亡)由细胞的外部传递到细胞内部，从而使细胞的发育和凋亡得到调控。

本实验结果显示在培养第4 天后实验组细胞迅速增长，体积增大，细胞间交织成网状，在细胞数量和形态上均优于对照组细胞。通过反应细胞代谢活性的MTT 实验测试，实验组与对照组比色后的OD 值，经统计学分析差异有统计学意义(P＜0.01)。神经元细胞的增值、分化等体外生物学特性受多种因素影响，与嗅鞘细胞共同培养后生物学特性的变化的信号通路目前尚不清楚，有待进一步研究。