微小核糖核酸miR-449a 通过凋亡及细胞周期对结直肠癌转移癌细胞LOVO 的影响

王岚玉，马煜，张洁，张国志，陈建立

(华北理工大学附属医院普外科，河北 唐山)

0 引言

微小RNA(miRNA)是一种进化上保守的内源性的小非编码RNA，主要通过靶向结合3’-UTR，调节mRNA 的稳定性和蛋白的翻译来发挥作用[1]。在过去的十几年里，很多体内和体外的实验研究已经证明，miRNA 在肿瘤的发生发展中起关键作用[2]，有些miRNA 已被提出作为癌症治疗的新型潜在靶标[3]。目前为止，有研究表明miR-449a 在多种肿瘤中呈现较低表达，包括肝癌、胃癌等，能够抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和转移[4-5]。本实验旨在探究miR-449a 在结直肠癌转移癌细胞中的表达，观察在结直肠癌细胞株中过表达和敲低miR-449a 对结直肠癌转移癌细胞凋亡和细胞周期的影响，并研究此过程细胞中一些凋亡相关蛋白的表达情况。

1 材料与方法

1.1 材料

miR-449a mimics 和mimics NC，miR-449a Inhibitor 和Inhibitor NC(锐博公司)；人结肠黏膜上皮细胞系NCM460 以及人结直肠癌细胞系SW480、人结直肠癌转移癌细胞LOVO；胎牛血清；RPMI-1640 培养基；磷酸缓冲盐溶液；trizol；Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen)；PCR 引物、miRNAqPCR Kit；BCA 蛋白浓度测定试剂盒；Bradford 蛋白测定试剂(碧云天生物股份有限公司)；一抗兔抗B 淋巴细胞瘤/白血病-2 基因(Bcl-2)、一抗兔抗Bcl-2相关蛋白X、天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶-3；一抗鼠抗β-微管蛋白，辣根过氧化物酶标记的二抗羊抗小鼠IgG、辣根过氧化物酶标记的二抗羊抗兔IgG；超敏ECL 发光试剂盒；聚偏二氟乙烯膜(PVDF 膜)；Total RNApure reagent 试剂盒(北京庄盟生物基因公司)；RevertAid Frist Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒(赛默飞世尔科技公司)；2×SYBR qPCR Mix(北京庄盟生物基因公司)；一步法TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒(绿色荧光)(碧云天生物股份有限公司)；细胞周期检测试剂盒(联科公司)。

1.2 细胞培养

SW480、HT29、HCT15、LOVO 和NCM460 细胞株分别在添加10%胎牛血清的RPMI-1640 培养液培养，置于37℃，5%CO2 培养箱中常规培养，每天换液一次，取对数生长期的细胞用于后续实验。

1.3 dsRNA、miRNA 序列的选择和细胞转染

miR-449a mimics 和mimics NC，miR-449a Inhibitor 和Inhibitor NC 由锐博生物公司设计制作。取对数生长期的细胞接种与6 孔细胞培养板，转染时细胞融合度约为50%至80%时，根据对结直肠癌细胞的不同处理分为4 组：上调组，上调对照组，下调组，下调对照组。更换无血清RPMI-1640 培养基12h 后，采用转染试剂Lipofectamine 2000 进行转染实验，进行转染4 至6h 后，更换新完全培养基，24h 后观察细胞状态并及时更换完全培养基。每组设置三个复孔，实验重复3 次。

1.4 总RNA 的提取和qPCR 分析

将转染48h 后的收集的细胞放置在1.5mL 的离心管中，利用Trizol 法提取细胞中总RNA，然后分析细胞中miR-449a 的表达水平。miR cDNA 合成参照赛默飞世尔科技公司RevertAid Frist Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒说明操作。加样完成后，将其放置在PCR 仪中进行逆转录，运行程序：在42℃，60min；70℃，5min。以逆转录反应获得的cDNA 做模板，按照北京庄盟生物基因公司2×SYBR qPCR Mix 试剂盒说明操作，反应条件为：①预变性：94℃、3min、1 个循环；②PCR 扩增：共40 个循环，每个循环包括变性(94℃、15s)、退火(60℃、30s)、延伸(72℃、30s)。利用荧光定时定量PCR 仪进行上述实时定量PCR 反应及检测，U6snRNA作为内参。每组设置三个复孔，实验重复3 次。结果数据采用2-△△CT 方法分析。

1.5 TUNEL 法检测细胞凋亡

将转染后的结肠癌细胞及空白组培养24h 后(n=4)，通过TUNEL 检测法检测各组细胞的凋亡情况：将4 组细胞爬片用4%多基聚甲醛固定30min，PBS 缓冲液洗5min，加入含0.1% TritonX-100 的PBS 冰浴孵育2min，PBS 缓冲液冲洗2 次×10min，将TUNEL 工作液加入6 孔板中37℃避光孵育60min，PBS 缓冲液冲洗3 次×10min，DAPI 染色液染色10min，PBS 缓冲液冲洗3 次×5min，将爬片取出，抗荧光淬灭剂封片，免疫荧光显微镜下采集图片。用Image-ProPlus6.0 软件随机抽取6 个区域分别测定TUNEL 荧光数量，DAPI 染色细胞核数量，用TUNEL 荧光数量/DAPI 细胞核数量表示凋亡细胞水平。实验重复 3 次。

1.6 Western blot

将转染后的结肠癌细胞及空白组常氧培养24h 后(n=4)，将处理好的细胞培养板取出后，加入4℃预冷的PBS 溶液漂洗3 遍，吸尽残留的PBS 溶液，加入RIPA 裂解液，于冰上裂解，30min 后用细胞刮收集蛋白，然后超速离心后取上清，运用BCA 法测定蛋白浓度，并按比例加入SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液(10×)混匀，煮沸5min，保存于-20℃。取16μg/孔蛋白上样，8%分离胶进行电泳，将相应分子量的蛋白转移至PVDF 膜，BSA 封闭2h，分别与相对应的一抗(bcl-2、bax、caspase-3、β-tublin)4℃摇床过夜，TBST 洗4 次，每次5min。再分别与抗兔的HRP 标记的二抗室温孵育2h，TBST 洗4 次，每次5 min，最后使用ECL 化学发光。用灰度值表示。实验重复3 次。

1.7 细胞周期分布分析

经过指定的处理后，用胰蛋白酶收集细胞，用磷酸盐缓冲液洗涤两次，然后使用细胞周期染色试剂盒(联科生物，杭州，中国)用DNA 染色溶液和碘化丙啶染色30 分钟。通过流式细胞仪评估染色的细胞，并通过FlowJo 软件(TreeStar，Ashland，OR，USA)分析数据。

表1 转染各组LOVO 结肠癌转移癌细胞BCL-2、BAX 及caspase-3 蛋白相对表达量

1.8 数据分析

所有数据采用统计软件 SPSS 20.0 分析，数值均采用表示。多组比较采用单因素方差分析法，两两比较用LDS 法；两组比较采用t 检验。

2 结果

2.1 人结直肠癌细胞系中miR-449a 信使RNA 的表达量明显下降

如图所示(图1)miR-449a 在结直肠癌细胞系中的表达RTqPCR 结果显示，在人结肠黏膜上皮细胞系NCM460 和人结直肠癌细胞系HCT15、HT29、SW480、人结直肠癌转移癌细胞系LOVO 中miR-449a mRNA 的相对表达量分别为(0.148±0.193)、(0.062±0.043)、(0.017±0.006)、(0.002±0.003)。与正常人结肠黏膜上皮细胞系NCM460 中的miR-449a 信使RNA 的表达相比较，人结直肠癌细胞系中miR-449a 信使RNA 的表达量明显下降，差异有统计学意义(P 均＜0.001).结果表明，在结直肠癌细胞系中，miR-449a 均呈较低表达，我们选择LOVO 继续后面实验研究。

图1 人结肠黏膜上皮细胞系NCM460 与结肠癌细胞系的miR-449a 相对表达情况

2.2 转染miR-449a 的mimics、Inhibitor 后细胞内miR-449a的水平检测(RT-qPCR)

转染后将细胞在培养箱培养24h 后，用RT-qPCR 检测细胞内miR-449a 的水平。如图所示(图2、3)，转染过表达质 粒miR-449a-mimics 后，LOVO 细 胞miR-449a 表 达 量 为7945.787±848.388。转染敲低质粒miR-449a Inhibitor 后，LOVO细胞miR-449a 表达量为0.593±0.064。数据均具有统计学意义(P均＜0.05)，说明转染成功。

图2 转染过表达质粒的LOVO 结肠癌转移癌细胞的对照组和实验组比较

2.3 转移癌细胞株LOVO 中miR-449a 过表达和抑制对bcl-2、bax、caspase-3 的影响(Western blot)

图3 转染敲低质粒的LOVO 结肠癌转移癌细胞的对照组和实验组比较

Western blot 结果显示，上调组的LOVO 细胞，与上调NC 组及空白组相比，caspase-3，bax 的表达升高，bcl-2 的表达下降(P均＜0.01)；而在下调组与下调NC 组、空白组相比，bcl-2、bax、caspase-3 的表达则无明显差异(P 均＞0.05)；空白组、上调NC 组、下调NC 组各细胞组比较无统计学差异(P 均＞0.05) (如图4、表1)。

图4 转染各组LOVO 结肠癌转移癌细胞BCL-2、BAX 及caspase-3 蛋白相对表达量

2.4 转移癌细胞株LOVO 中miR-449a 过表达和抑制对结肠癌细胞凋亡的影响(TUNEL)

TUNEL 实验检测结果显示，和上调NC 组、空白组相比，上调组的结直肠癌细胞明显凋亡增加(P＜0.001)，而下调组与下调NC 组、空白组则无明显差异(P＞0.05)；空白组、上调NC组、下调NC 组各细胞组比较无统计学差异(P 均＞0.05)(如图7)。[TUNEL-阳性细胞比值：空白组(0.110±0.013)；上调NC组(0.108±0.003)；上调组(0.179±0.038)；下调组(0.088±0.008)下调NC 组(0.118±0.018)]。

2.5 转移癌细胞株LOVO 中miR-449a 过表达和抑制对结肠癌细胞细胞周期的影响

上调NC 组处于G0/G1 期的细胞百分比高于空白组和上调NC 组(P＜0.01)，出现明显的G0/G1 期阻滞，下调组与下调NC 组、空白组则无明显差异(P＞0.05)；上调组进入S 期和G2/M 期的细胞百分比均低于空白组和上调NC 组(P 均＜0.01)，下调组与下调NC 组、空白组则无明显差异(P 均＞0.05)；空白组与下调组、下调NC 组各细胞周期百分比比较无统计学差异(P 均＞0.05)(见表2)。

表2 转染各组结肠癌转移癌细胞LOVO 的细胞周期百分比比较

3 讨论

图7 转染各组LOVO 结肠癌转移癌细胞tunel 表达量

结肠癌的发生是遗传、饮食、环境、生活习惯及肠道微生态等多因素共同作用的结果，在我国发病率呈逐年上升且年轻化趋势[6]。由于相关预防保健知识的缺乏，在我国及其他发展中国家，大多数结肠癌患者在发现时已处于疾病中晚期，丧失手术机会。因此，分子靶向治疗在晚期肿瘤治疗中的运用，已经成为治疗的新关注点[7]。研究表明，多种miRNA 在结直肠癌中有比较重要的作用。本研究通过检测了几种常见结肠癌细胞株和人结肠黏膜上皮细胞系NCM460 中miR-449a 的表达，结果证明了在结肠癌细胞系中miR-449a 也呈较低表达。

作为脊椎动物中进化保守的miRNA，miR-449a 在肿瘤发生进程中的作用也受到广泛关注.研究发现，miRNAa 在肝癌、膀肌癌、结肠癌及胃癌病人的癌组织中的表达普遍低于癌旁正常组织[8-11]。本研究通过转染技术而过表达结肠癌细胞株SW480 和转移癌lovo 中miR-449a，研究其对肿瘤细胞凋亡的影响。结果表明，miR-449a 明显促进细胞凋亡，同时检测各组细胞中凋亡相关蛋白的表达发现，bcl-2 蛋白表达下降较显著，而bax、caspase-3蛋白的表达却上调。

Bcl-2 是线粒体凋亡途径的关键调节因子，能够通过抑制细胞色素C 从线粒体膜间隔释放到细胞质中而发挥其抗凋亡功能[12]。有软件预测bcl-2 很有可能是miR-449a 的一个靶向结合基因[13]，而miRNA 能够与靶基因mRNA3’-UTR 结合，在转录后水平调节基因表达。有资料显示，在多种肿瘤细胞的凋亡过程中，发现有caspase 的活化[14-15]。因此，我们推测miR-449a 的异常表达可能结肠癌具有相关性，可能是通过下调靶基因bcl-2 的表达而引起bax 蛋白的改变，同时激活了caspase-3 蛋白的表达，最终引起了结肠癌细胞的凋亡。当然，miR-449a 可能也有很多其他的靶基因，通过改变这些个基因的表达引起细胞凋亡，这也是今后继续研究的方向和切入点。