miR-206过表达对甲状腺乳头状癌细胞增殖和迁移的影响*

杜喜风， 胡志辉， 景敏洁， 王雅婷， 兰丽珍

（山西医科大学第一医院内分泌科，山西太原030001）

甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是最常见的内分泌恶性肿瘤，且近年来其发病率呈逐年上升趋势。约有10%～15%的PTC患者常出现远处转移和复发，导致其标准治疗的效果较差，预后不佳［1］。因此，研究PTC形成和发展的分子机制是十分必要的，对寻找PTC治疗新药，提高PTC患者的预后具有重要意义。

微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是一类广泛存在于真核细胞中由基因组编码的长度约22个核苷酸的小型非编码RNA，通过和靶基因mRNA碱基完全或不完全配对进而诱导沉默复合体降解mRNA或阻碍其翻译，进而调节细胞生长、分化、增殖和代谢等基本的生理过程［2］。大量研究已经证实，异常表达的 miRNA 如 miR-105［3］、miR-300［4］等能够从转录后水平调控各种致癌或抑癌基因的表达，从而调控多种恶性肿瘤的发生和发展。近期研究发现，miR-206 在多种癌症中如乳腺癌［5］、肝癌［6］、胃癌［7］、喉癌［8］等有异常表达，表明它与肿瘤的发生和发展密切相关。Liu等［9］研究发现，miR-206的表达量在PTC组织中较正常组织中低。但miR-206对PTC具体生物功能及机制尚未阐明。

肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）的受体c-Met是原癌基因编码的一种190 kD的蛋白，是具有确定的致癌特性的受体酪氨酸激酶，在正常细胞发育和肿瘤发生中起重要作用。c-Met与HGF结合后，引起受体酪氨酸激酶结构域的自磷酸化，激活蛋白激酶，导致酪氨酸残基磷酸化并激活PI3K/Akt/mTOR通路［10］。异常激活的c-Met/Akt/mTOR信号通路与甲状腺癌、宫颈癌等多种恶性细胞的增殖和迁移密切相关［11-12］。然而，在PTC中，miR-206能否通过抑制c-Met/Akt/mTOR信号通路而发挥抑癌作用，鲜有相关报道。本研究旨在研究miR-206过表达对PTC细胞增殖和迁移的影响并探索其可能的机制，为PTC临床靶向治疗筛选新的分子干预靶点。

材料和方法

1 主要试剂

人甲状腺乳头状癌K1细胞株购自欧洲细胞培养中心。DMEM/F12培养液购自HyClone；澳洲胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自 CellMax；LipofectamineTM3000转染试剂购自Invitrogen；TRIzol试剂购自北京聚合美生物科技有限公司；CCK-8和BCA蛋白浓度测定试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司；Transwell小室购自Corning；hsa-miR-206模拟物（hsa-miR-206 mimic）和阴性对照无关序列均购自上海吉玛基因；反转录试剂盒All-in-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit购自GeneCopoeia；实时荧光定量PCR试剂盒ChamQTMUniversal SYBR®qPCR Master Mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司；双萤光素酶报告基因检测试剂盒购自Promega；抗 c-Met、p-Met、AKT、p-AKT、mTOR、pmTOR和β-actin抗体均购自上海生工。

2 主要方法

2.1 K1细胞培养与转染 K1细胞用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM/F12培养液，在37℃、5%CO2条件下培养。将实验分为3组，即空白（blank）组（未行任何转染）、阴性对照（miR-NC）组（转染阴性对照序列miR-NC）和实验组（miR-206 mimic组；转染miR-206 mimic）。在转染前1 d，对细胞株进行传代，且更换为无双抗的培养基，计数9.0×105个K1细胞均匀接种于6孔板中培养，待细胞汇合度约70%时，再行细胞转染。按照LipofectamineTM3000使用说明书，吸取miR-206 mimic和miR-NC（浓度均为50μmol/L）各4μL，溶解于100 μL Opti-MEM培养液为A液，同时吸取LipofectamineTM3000试剂4μL，溶解于100μL Opti-MEM培养液为B液，均静置5 min。A液和B液混合，室温静置20 min后加入细胞培养板中，总体积为2 mL。于37℃、含5%CO2的孵箱中培养6 h后，更换为完全培养基继续培养24 h，收集细胞进行后续实验。

2.2 RT-qPCR实验 采用TRIzol法提取上述各组细胞的总RNA，测定RNA的浓度及纯度后，按照反转录试剂盒All-in-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit说明书将RNA反转录成cDNA。以此cDNA为模板，采用RT-qPCR试剂盒进行实时荧光定量PCR以检测miR-206表达量。引物均购自上海生工。miR-206的上游引物序列为5′-TGGAATGTAAGGAAGTGTGTGG-3′，下 游 引 物 序 列 为 5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；内参照U6的上游引物序列 为 5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物序列为 5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′。反应体系包括：Universal SYBR®qPCR Master Mix试剂10μL，模板cDNA 2μL，上、下游引物（浓度均为10 μmol/L）各0.4μL，无RNA酶的双蒸水7.2μL。扩增反应条件为：95℃预变性30 s；95℃10 s，60℃30 s，共40个循环。结果得出Ct值，采用2-ΔΔCt法计算各组miR-206的相对表达水平，以检验转染效果。

2.3 CCK-8和活细胞计数实验检测细胞的增殖能力 将转染24 h后的各组K1细胞分别接种于96孔板，细胞密度为每孔3×103个，每孔100μL，每组设3个重复孔。分别将细胞培养0、24、48和72 h后，终止培养；向各孔中加入10μL CCK-8溶液，继续培养1 h。用酶标仪检测各孔在波长450 nm处的吸光度（A450）。以时间为横坐标，A450值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。实验重复3次。用0.04%台盼蓝对各组消化后的细胞染色，进行活细胞计数（活细胞数=总细胞数-着色的死细胞数），每个样品计数3次。

2.4 Transwell实验检测细胞迁移能力 收集上述转染后处于对数生长期的各组K1细胞，计数2×104个细胞，用200μL无血清培养基重悬，加入Transwell细胞培养板的小室上室，下室加入500μL含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液。每组设3个复孔。在37℃、含5%CO2的孵箱中孵育24 h后，取出Transwell小室，用棉签轻轻拭去微孔膜上层的细胞，用4%多聚甲醛溶液固定下层细胞20 min，PBS洗3次；再用0.1%结晶紫染色液室温染色10 min，PBS洗3次；小室干燥后置于光学显微镜下观察，随机选取5个视野拍照、计数穿膜细胞。以穿膜细胞的相对数目表示肿瘤细胞的迁移能力。实验重复3次。

2.5 双萤光素酶报告基因实验检测miR-206对c-Met基因的靶向作用 用TargetScan 7.1（www.targetscan.org/vert_71/）预测 miR-206 与其靶基因 3′端非翻译区（3′-untranslated region，3′UTR）的结合位点。通过GenePharma合成野生型（pGL3-c-Met-3′UTR WT）和突变型（pGL3-c-Met-3′UTR MUT）c-Met萤光素酶报告载体。将K1细胞接种在24孔板中培养过夜，待细胞密度约90%时，使用LipofectamineTM3000将 pGL3-c-Met-3′UTR WT 或 pGL3-c-Met-3′UTR MUT与miR-206 mimic或miR-NC共同转染至K1细胞，每组设3个复孔，转染48 h后，按双萤光素酶活性检测试剂盒说明书提供的方法，在单光子检测仪上检测，计算相对萤光素酶活性。相对萤光素酶活性=萤火虫萤光素酶活性值/海肾萤光素酶活性值。实验重复3次。

2.6 Western blot检测相关蛋白的表达水平 收集转染48 h后对数生长期的各组K1细胞，用RIPA蛋白裂解液抽提细胞全蛋白，冰上静置30 min，离心后取上清液。BCA法测定蛋白质浓度。将SDS-PAGE分离后的蛋白质转到聚偏二氟乙烯膜上。使用含5%脱脂奶粉和Tween 20的磷酸盐缓冲液室温封闭，分别加入对应I抗，4℃过夜孵育；加入HRP标记的II抗。采用增强化学发光法通过Bio-Rad凝胶成像系统成像，采用Quantity One分析软件测定目的蛋白与相应内参照（β-actin）的灰度值，取其比值即为目的蛋白的相对表达量。实验重复3次。

3 统计学处理

应用SPSS23.0进行数据处理和统计分析。计量资料用均数±标准差（mean±SD）表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Bonferroni校正的t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 转染后实验组K1细胞中miR-206的相对表达量升高

K1细胞瞬时转染miR-206 mimic后，RT-qPCR结果显示，与空白组和阴性对照组相比较，实验组miR-206的相对表达量显著升高（P＜0.01），见图1。

Figure 1.The expression level of miR-206 in the PTC K1 cells transfected with miR-206 mimic.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs blank group or miR-NCgroup.图1 miR-206在甲状腺乳头状癌K 1细胞中的表达水平

2 过表达miR-206抑制K1细胞的增殖能力

CCK-8实验结果显示，转染miR-206 mimic的实验组中K1细胞的活力较空白组和阴性对照组明显受到抑制（P＜0.01），见图2A。在活细胞计数实验中，实验组存活K1细胞的数目较空白组和阴性对照组均明显减少（P＜0.01），见图2B。

3 过表达miR-206抑制K1细胞的迁移能力

Transwell实验结果显示，培养24 h后实验组的迁移细胞数明显低于空白组和阴性对照组（P＜0.01），见图3。这表明过表达miR-206可抑制K1细胞的迁移能力。

Figure 2.The effect of miR-206 over-expression on the proliferation ability of PTCK1 cells.A：the cell viability was measured by CCK-8 assay；B：the living cell numbers were counted by the method of Trypan blue exclusion.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs blank group or miR-NCgroup.图2 miR-206过表达对甲状腺乳头状癌K 1细胞增殖能力的影响

Figure 3.The effect of miR-206 over-expression on the migration ability of PTC K1 cells（crystal violet staining，×100）.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs blank group or miR-NCgroup.图3 miR-206过表达对甲状腺乳头状癌K1细胞迁移能力的影响

4 K1细胞中miR-206靶向调控c-Met基因

通过TargetScan 7.1软件检索miR-206的靶基因，发现c-Met基因的3′UTR上存在1个潜在的miR-206结合位点，见图4A。双萤光素酶报告基因实验结果显示，在K1细胞中，与空白组（0.97±0.07）和阴性对照组（0.96±0.03）相比，miR-206过表达能够显著抑制野生型c-Met3′UTR的相对萤光素酶活性（0.51±0.05），差异有统计学意义（P＜0.01）；当c-Met基因3′UTR中的miR-206结合位点发生突变后，miR-206过表达对靶基因的抑制作用消失，即miR-206 mimic转染组的相对萤光素酶活性（0.99±0.08）与空白组和阴性对照组相比，差异无统计学显著性（P＞0.05），见图4B。以上结果充分说明，miR-206通过与c-Met基因的3′UTR相互作用，负调控靶基因c-Met的表达。

Figure 4.c-Met gene was directly targeted by miR-206 in PTC K1 cells.A：schematic diagram of c-Met 3′UTR targeted by miR-206；B：luciferase activity of the WTc-Met 3′UTR was dramatically inhibited in miR-206 mimic group.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs blank group or miR-NCgroup.图4 c-Met是miR-206的靶基因

5 过表达miR-206可抑制K1细胞c-Met/AKT/mTOR信号通路激活

Western blot实验结果显示，转染miR-206 mimic的K1细胞中，p-Met、p-AKT和p-mTOR的蛋白水平与空白组和阴性对照组相比均明显降低（P＜0.01），而其总蛋白均未见明显改变，见图5。这提示miR-206过表达可抑制c-Met/AKT/mTOR信号通路激活，进而抑制K1细胞的增殖和迁移能力。

Figure 5.The protein levels of c-Met，p-Met，AKT，p-AKT，mTOR and p-mTOR after transfection with miR-206 mimic in PTCK1 cells.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs blank group or miR-NCgroup.图5 转染miR-206 mimic后，各组K1细胞中c-Met/AKT/mTOR通路相关蛋白的表达水平

讨 论

甲状腺癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，女性发病率较男性高。而PTC为最常见的甲状腺癌病理类型，约占甲状腺癌的84%，它起源于滤泡上皮细胞，易发生淋巴结转移［13］。miRNA是一类与恶性肿瘤密切相关的基因调控因子，且前期研究表明，多种miRNA在PTC细胞中均表达异常。miR-138-5p可能通过依赖性抑制LRRK2进而抑制PTC细胞增殖［14］；miR-497通过直接靶向调节AKT3抑制PTC细胞的活力和迁移［15］。尽管许多研究者对miRNA在PTC发生发展过程中的作用进行了大量研究，但由于其复杂性，PTC具体发病机制仍未完全阐明。

研究表明，miR-206可以调节细胞的增殖、分化和凋亡等基本过程［16］。在许多人类恶性肿瘤中，miR-206发挥抑癌因子作用，例如在儿童急性髓系白血病中，miR-206通过靶向细胞周期蛋白D1发挥抑癌作用［17］；在前列腺癌细胞中，miR-206 与 ANXA2 mRNA结合可能调控EMT信号通路，从而抑制其侵袭转移［18］。本研究通过对PTCK1细胞瞬时转染miR-206 mimic，发现实验组miR-206的相对表达量较空白组和阴性对照组显著升高，表明转染成功。采用CCK-8和活细胞计数实验检测细胞增殖能力，以及Transwell实验检测细胞迁移能力，发现K1细胞的增殖和迁移能力均明显受到抑制，表明miR-206可抑制甲状腺乳头状癌K1细胞增殖和迁移能力。

PI3K/AKT/mTOR信号通路是膜受体信号向细胞内转导的重要途径之一，在细胞增殖、迁移以及凋亡等过程中发挥着重要作用［19］。c-Met与HGF相结合后，细胞内发生自身磷酸化，可激活PI3K/AKT/mTOR信号通路，诱导细胞发生增殖、迁移等生物学反应［20］。Zheng等［7］发现 miR-206 可通过调控 c-Met基因表达，抑制胃癌细胞的增殖及迁移。在肝癌中，miR-206亦可靶向调控功能靶点c-Met和Cdk6，以介导其抑癌作用［21］。有研究表明，95%以上的PTC组织中发现c-Met蛋白高表达［22］。本研究结果显示，在K1细胞中，miR-206通过与c-Met基因的3′UTR相互作用，进而负调控靶基因c-Met的表达；且证实过表达miR-206后，p-Met、p-AKT和p-mTOR蛋白表达水平均降低。这提示K1细胞的增殖和迁移能力受到抑制，可能是由过表达miR-206降低c-Met蛋白的表达水平，进而抑制下游AKT/mTOR信号通路的激活所致。

综上所述，miR-206可抑制甲状腺乳头状癌K1细胞的增殖和迁移能力，其作用机制可能与miR-206抑制c-Met/AKT/mTOR信号通路激活有关。这不仅为研究miR-206抑制PTC增殖和转移的具体机制提供了新的实验依据，而且miR-206/c-Met或可成为PTC临床靶向治疗中一个新的分子干预靶点。