妊娠期脂多糖暴露通过激活子代小胶质细胞诱导大鼠孤独症样行为*

俸 笛，陈保林，肖 露，杨 亭，陈 洁，孙五庆

（重庆医科大学附属儿童医院儿童营养研究中心，国家儿童健康与疾病临床医学研究中心，儿童营养与健康重庆市重点实验室，儿童发育疾病研究教育部重点实验室，儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地，重庆400014）

孤独症谱系障碍（autism spectrum disorders，ASD）是1943年由Kanner提出的一组以社会交往障碍以及重复刻板行为为特征的神经发育障碍性疾病［1］。尽管ASD的患病率在世界范围内呈逐年上升趋势［2］，但其具体发病机制尚不清楚，防治方法非常受限，给ASD患儿的家庭带来了严重的负担。临床研究表明妊娠期间的母源性免疫激活（maternal immune activation，MIA）会对发育中的胎儿产生影响，增加其子代患自闭症的风险［3］。

小胶质细胞是脑内重要的免疫细胞，是中枢神经系统损伤的主要防御细胞［4］。一般认为小胶质细胞有两种不同的表型，即具有促炎功能的M1型和具有免疫抑制功能的M2型［5］。有研究发现，炎症细胞因子的增加及小胶质细胞的持续激活可能导致机体呈慢性炎症状态，引起神经损伤及发育障碍［6］。同时有学者发现孤独症患者大脑中存在免疫功能异常［7］。Toll样受体 4（Toll-like receptor 4，TLR4）是一种跨膜受体，在脑组织中主要表达于神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞上，参与小胶质细胞介导的炎症反应，并导致白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）等的产生和分泌［8］。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是TLR4的特异性配体，通过脂多糖结合蛋白（lipopolysaccharide-binding protein，LBP）介导与CD14的结合，激活TLR4信号通路［9］。大鼠孕期腹腔注射LPS可模拟人类妊娠期感染，是一种较常见的MIA动物模型［10］，通过对其子代的行为学检测，可观察子代是否存在社会交往障碍、重复刻板等孤独症样行为。因此，本研究利用LPS诱导妊娠期MIA大鼠模型，检测仔鼠孤独症样行为，分析小胶质细胞不同亚型及TLR4表达水平的变化，探讨小胶质细胞表型与孤独症样行为的相关性。同时体外培养N9小胶质细胞系，利用TLR4抑制剂TAK242，探讨小胶质细胞分型与TLR4的联系。

材料和方法

1 实验动物

SPF级健康雌性8周龄Sprague-Dawley（SD）大鼠24只，体质量190～210 g，购买自重庆医科大学实验动物中心，生产许可证号为SCXK（渝）2018-0003，饲养于重庆医科大学附属儿童医院IVC（individually ventilated caging）级实验动物中心，使用许可证号为SYXK（渝）2017-0012。所有动物实验流程通过重庆医科大学动物中心实验动物伦理委员会核准。

2 实验主要试剂

LPS（Sigma）；TLR4、离子钙结合衔接分子 1（ionized calcium-binding adaptor molecule-1，IBA-1）、iNOS、精氨酸酶1（arginase-1，Arg-1）和GAPDH引物序列（北京华大公司）；总mRNA提取试剂盒和RIPA裂解液（BioTeke）；逆转录试剂盒及RT-PCR试剂盒（TaKaRa）；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（Bio-Rad）；抗IBA-1和iNOS抗体（Abcam）；抗Arg-1抗体（Genetex）；抗TLR4抗体（Santa Cruz）；IL-10及TNF-α酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（RayBiotech）；LBP ELISA 试剂盒（Arigobio）。

3 实验方法

3.1 实验动物分组及模型构建 参照Fernández等［11］及本实验室已发表文献［12-13］的方法构建孤独症样行为的大鼠模型。雌雄大鼠1∶1放入笼子过夜，第2天早晨观察到阴栓的雌鼠记为怀孕第1天（gestation day 1，G1），并将其单独饲养。如图1所示，将24只孕鼠随机平分成LPS组和磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）组（n=12），在G9.5时LPS组孕鼠腹腔注射100μg/kg LPS，PBS组腹腔注射等体积PBS。腹腔注射24 h后，每组孕鼠随机抽取3只收集孕鼠血清检测LBP及TNF-α，验证模型构建是否成功。每组剩余9只孕鼠待其自然生产（每只孕鼠产仔8～10只），本研究中每只母鼠哺乳8只仔鼠，即每组仔鼠共72只（n=72）。为排除不同行为学测试可能对大鼠脑组织产生影响，每组随机抽取42只子代大鼠在生后第42～56天分别进行三箱社交实验（n=14）、嗅觉适应/去适应实验（n=14）及旷场实验（n=14），每组剩余的30只仔鼠用于real-time PCR、Western blot、免疫荧光等实验。

Figure 1.Diagramillustrating the experimental protocols in the rats in vivo.图1 动物体内实验流程图

3.2 生物标本的采集及处理 孕鼠G9.5腹腔注射LPS或PBS24 h后，麻醉后股动脉取全血约2 mL，血标本静置0.5 h后以1 000×g离心15 min，留取上清，冻存于-80℃冰箱。各组子代大鼠8周龄时麻醉后冰上取脑前额叶皮质，冻存于-80℃备用。

3.3 N9细胞培养及处理 从液氮中取出N9细胞系，迅速复苏后种于10 cm的培养皿中，加入含10%FBS的DMEM/F12培养液（内含1%青霉素及链霉素），在37℃、5%CO2培养箱中培养，每天更换新鲜培养液。待细胞传至P3代后种于6孔板中，分为3组：（1）对照（control）组；（2）LPS组；（3）TAK242+LPS组。其中第3组予以50μmol/L TAK242干预4 h后加入3 mg/L LPS处理12 h，第2组则加入同等体积DMSO（TAK242的溶剂）处理4 h后予以3 mg/L LPS处理12 h。

3.4 real-time PCR检测 提取前额叶皮质或N9细胞总mRNA，将mRNA逆转录为cDNA，在Bio-Rad实时荧光定量PCR仪上进行qPCR扩增。各目的基因以GAPDH为内参照。IBA-1的上游引物序列为5′-TGGATGGGATCAACAAGCAC-3′，下游引物序列为5′-GGAGCCACTGGACACCTCTC-3′；Arg-1 的上游引物序列为5′-GGGAAGGTAATCATAAGCCAGA-3′，下游引物序列为5′-CCCAGATGACTTTTATGCGATG-3′；iNOS 的 上 游 引 物 序 列 为 5′-CGCTACACTTCCAACGCAACA-3′，下游引物序列为 5′-GAACAATCCACAACTCGCTCCA-3′；TLR4的上游引物序列为5′-TAGCCGCTCTGGCATCAT-3′，下游引物序列为 5′-GCATTGTCCTCCCACTCG-3′；GAPDH的上游引物序列为5′-CCTGGAGAAACCTGCCAAG-3′，下游引物序列为5′-CACAGGAGACAACCTGGTCC-3′。

3.5 Western blot检测 取出冻存的前额叶皮质脑组织，加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。SDS-PAGE进行蛋白分离，恒流湿转法冰上转膜，BSA封闭，I抗孵育4℃过夜，PBST漂洗3次后加入相应II抗室温孵育1 h，PBST漂洗后ECL发光显影。

3.6 ELISA检测 采用ELISA测定母鼠血清LBP和TNF-α及子代大鼠前额叶皮质中TNF-α和IL-10的含量，实验步骤严格按照说明书操作。

3.7 组织免疫荧光染色 各组大鼠8周龄时行心脏灌注，将脑组织完整剥离放入4%多聚甲醛中固定，3 d后移入含30%蔗糖的4%多聚甲醛脱水，组织沉底后行冰冻切片。0.3%的Triton X-100打孔20 min，BSA封闭。I抗（抗IBA-1抗体，1∶500）4℃过夜。PBS漂洗3次后加入对应的荧光II抗，室温避光孵育1 h，PBS室温避光洗3次后，滴加抗荧光淬灭剂，盖上盖玻片。在Nikon自动生物荧光显微镜下避光拍照。

3.8 行为学检测

3.8.1 三箱社交实验 采用透明塑料三箱，正式实验前一天将大鼠依次从中间箱放入，让其适应5 min。测试当天，陌生鼠箱放入一只同龄、同性别大鼠，玩具箱放入一个玩具，将被试大鼠再次从中间箱相同位置放入，ANY-maze软件及配套摄像系统将自动记录其在陌生鼠箱、玩具箱和中间箱的运动轨迹及时间，每只大鼠测试5 min。

3.8.2 嗅觉适应/去适应实验 测试两组大鼠对水、鼠尿和啤酒的兴趣，采用一个干净干燥的箱子作为观察箱，被测大鼠放入观察箱内，使其依次嗅含有水、鼠尿和啤酒3种液体的棉签，每种棉签依次更换3支，每只大鼠共嗅9支棉签。每支棉签观察时间3 min，分别记录测试大鼠嗅不同棉签的总时间。

3.8.3 旷场实验 使用长宽高为50 cm×50 cm×45 cm的黑色塑料箱，依次将被试大鼠从测试箱正中间放入，每只大鼠测试时间10 min。在ANY-maze软件上将测试区域划分为9个相等面积的正方形区域（1个中间区和8个周围区），摄像系统记录其运动轨迹和跨线数。观看录像记录每只大鼠在箱内自梳理的时间。

3.9 细胞免疫荧光染色 将细胞爬片高温消毒后加入24孔板中，在此接种上N9细胞，经TAK242处理及LPS刺激后去除原培养液，4%多聚甲醛固定，PBST（含0.2%的Triton X-100）打孔，BSA封闭。I抗［抗TLR4抗体（1∶100）、抗iNOS抗体（1∶250）及抗Arg-1抗体（1∶400）］4℃孵育过夜，PBS漂洗3次后加入对应的荧光II抗，室温避光孵育1 h，PBS室温避光洗3次后加入DAPI 20 min，清洗3次后取出盖玻片，倒扣于滴加了抗荧光淬灭剂的载玻片上，Nikon荧光显微镜观察。

4 统计学处理

利用GraphPad Prism软件进行统计分析。计量资料采用均数±标准差（mean±SD）表示。两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 母鼠血清LBP及TNF-α水平变化

妊娠期予以LPS腹腔注射的母鼠血清LBP浓度较PBS组显著升高（P＜0.01），同时伴有炎症因子TNF-α分泌水平显著增加（P＜0.05），见图2。

Figure 2.The levels of serum LBP（A）and TNF-α（B）in the pregnant rats with different treatments.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs PBSgroup.图2 妊娠期不同处理组孕鼠血清LBP及TNF-α分泌水平

2 子代大鼠前额叶皮质TLR4和IBA-1的表达变化

妊娠期给予LPS处理后的仔鼠前额叶皮质中TLR4的mRNA和蛋白表达水平较PBS组显著升高（P＜0.05），见图3A、C；LPS组仔鼠前额叶皮质中IBA-1的mRNA和蛋白表达水平也较PBS组显著升高（P＜0.05），见图3B、D。

3 子代大鼠前额叶皮质iNOS和Arg-1的表达变化

LPS组仔鼠前额叶皮质中iNOS的mRNA表达水平显著高于PBS组（P＜0.05），而Arg-1的mRNA表达水平却显著低于PBS组（P＜0.05），见图4A、B。同时Western blot结果显示，LPS组iNOS的蛋白表达水平较PBS组显著升高（P＜0.05），而Arg-1的蛋白表达水平却较PBS组降低（P＜0.01），进一步比较显示，LPS组子代大鼠前额叶皮质中iNOS/Arg-1表达水平比值较PBS组显著增加（P＜0.01），见图4C。

4 子代大鼠前额叶皮质TNF-α及IL-10水平变化

ELISA结果显示，LPS组仔鼠前额叶皮质TNF-α表达水平较PBS组显著升高（P＜0.01），而IL-10浓度却较PBS组显著降低（P＜0.01），见图5A、B。

5 子代大鼠前额叶皮质小胶质细胞形态学变化

免疫荧光结果显示，PBS组小胶质细胞的胞体浓缩，多向分支丰富且明显，而LPS组的小胶质细胞分支消失，胞体增大、松散；统计分析每20个小胶质细胞内有分支的细胞数，结果表明LPS组具有分支的小胶质细胞数量显著少于PBS组（P＜0.01），见图5C。

6 行为学实验

Figure 3.The mRNA（A，B）and protein（C，D）expression levels of TLR4（A，C）and IBA-1（B，D）in the prefrontal cortex of the pups in LPSgroup and PBSgroup.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，**P＜0.01 vs PBSgroup.图3 LPS组及PBS组子代大鼠前额叶皮质中TLR4和IBA-1表达水平的变化

三箱社交实验中，LPS组仔鼠停留在陌生鼠箱的时间显著低于PBS组（P＜0.01），而在玩具箱的时间却显著高于PBS组（P＜0.01）；嗅觉适应/去适应实验分别比较两组大鼠嗅蒸馏水、鼠尿和啤酒3种棉签的时间，观察到LPS组的子代大鼠嗅同龄陌生大鼠尿液的时间少于PBS组（P＜0.01），而嗅蒸馏水及啤酒的时间无显著差异；旷场实验中，LPS组仔鼠在测试中跨线数显著低于PBS组（P＜0.01），同时LPS组仔鼠在旷场中自梳理毛发时间却显著高于对照组（P＜0.01），见表1。

7 TAK 242处理后LPS诱导的N9细胞TLR4、iNOS及Arg-1表达的变化

LPS组TLR4的mRNA表达水平显著高于control及TAK242+LPS组（P＜0.01或P＜0.05），同时iNOS的mRNA表达水平较其它两组也有显著升高，但Arg-1的mRNA表达水平则显著下降（P＜0.01），见图6A。与LPS组相比，TAK242+LPS组的TLR4荧光强度显著降低（P＜0.01），见图6B。免疫荧光双染观察显示，LPS组小胶质细胞中的iNOS高表达，以M1型为主，而TAK242+LPS组中则Arg-1高表达，以M2型为主；量化分析表明LPS组iNOS荧光强度显著高于control组及TAK242组（P＜0.01），而Arg-1荧光强度则显著降低（P＜0.01），进一步将iNOS/Arg-1比值进行比较，显示LPS组iNOS/Arg-1比值显著高于control及TAK242+LPS组（P＜0.01），见图6C。

讨 论

当妊娠期间免疫系统被激活时，再与其它遗传和/或环境因素相结合，就有可能会增加特定神经发育障碍的发病风险，这一观点已逐渐达成共识［14］。过去30年的流行病学研究证实，女性妊娠期暴露于感染、炎症以及分娩时的高危因素均会增加子代神经发育性精神疾病（如精神分裂症、孤独症）的风险［15］。此外，动物模型研究表明，怀孕期间母体过度免疫反应与子代生后大脑的变化及其行为发育存在密切的联系［15］。孤独症儿童社会交流及交往障碍是最重要的症状，而啮齿动物的社会交往问题主要表现为与同伴动物互动减少，对社会气味（如鼠尿）［16］兴趣降低，因此三箱社交实验及嗅觉适应/去适应实验是评估啮齿动物社交能力的经典方法［17-22］。本研究中，我们观察到孕鼠LPS暴露后其子代大鼠与同伴交流的兴趣显著低于PBS组，而对玩具的兴趣却显著升高，同时对社会性气味的兴趣显著减少，提示母鼠妊娠期LPS暴露增加了其仔鼠社会交往障碍的风险。孤独症另一症状为重复刻板性行为，这可以通过大鼠的自梳理行为来检测［17-19］，同时大鼠在陌生环境中的活动和探索行为可以反映孤独症常伴有的焦虑等情绪问题［18-20］。旷场实验结果显示，妊娠期LPS暴露的仔鼠在陌生环境中的自主行为和探究行为减少，焦虑增加，而重复刻板行为增多。上述行为学结果表明妊娠期LPS暴露的母鼠所产仔鼠具有的孤独症样行为与ASD儿童临床表现基本一致。

Figure 4.The changes of iNOSand Arg-1 expression levels in the prefrontal cortex of the pups in LPSgroup and PBSgroup.A：the mRNA level of iNOS；B：the mRNA level of Arg-1；C：the protein levels of iNOSand Arg-1 and the ratio of iNOSto Arg-1.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，**P＜0.01 vs PBSgroup.图4 LPS组及PBS组子代大鼠前额叶皮质中iNOS和Arg-1表达水平的变化

人群研究结果表明，在LPS刺激下，ASD患儿血清TLR4表达及IL-1β、IL-6和TNF-α含量较正常对照组增加［23］，且IL-6及TNF-α的表达水平与孤独症核心症状及异常行为的严重程度呈正相关［24］。同时观察到孤独症患者大脑尸检标本中炎性细胞因子增加［7］，且免疫不耐受而导致的过敏、对疫苗过度反应、严重感染和未确诊的自身免疫性疾病等在ASD患者中更常见［25］。这些证据均提示免疫功能异常可能与孤独症密切相关。在本研究的动物模型中，我们也观察到了具有孤独症样行为的大鼠脑组织内存在炎性细胞因子TNF-α增加、抗炎细胞因子IL-10减少、小胶质细胞激活等免疫异常现象，与上述人群中的研究结果相一致。Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）表达在多种固有免疫细胞表面，在免疫激活过程中起着重要作用［26］。孕妇在妊娠期暴露于病原体或未知的损伤信号时，通过TLRs信号通路，特别是TLR4 信号通路，诱导先天免疫反应［27-28］。LPS 是TLR4的特异性配体，通过LBP介导与CD14的结合，激活TLR4/NF-κB信号通路，参与炎症应答［29］。在本研究中，妊娠期腹腔注射LPS后，母鼠血清LBP及TNF-α表达均较PBS组升高，同时仔鼠前额叶皮质中TLR4表达水平也显著升高，表明妊娠期LPS处理激活了母鼠免疫反应及子代大鼠脑组织中TLR4信号通路。TLR4在脑组织中主要表达于小胶质细胞，它参与了小胶质细胞介导的炎症反应，并导致IL-1β、TNF-α、iNOS等的产生和分泌［8］。有研究显示，使用TLR4信号通路抑制剂TAK242可抑制脓毒症脑病小鼠脑内小胶质细胞的活化，从而改善小鼠的学习记忆功能［30］。本研究中，我们观察到母鼠孕期LPS暴露后仔鼠前额叶皮质内小胶质细胞的数量增多，并伴有促炎细胞因子TNF-α分泌增加及抗炎细胞因子IL-10分泌减少，结合仔鼠前额叶皮质内TLR4表达增加，推测LPS诱导的MIA模型可能通过子代TLR4信号通路激活了前额叶皮质内的小胶质细胞。

Figure 5.The changes of TNF-α（A）and IL-10（B）levels and observation of microglial branches（C）in the prefrontal cortex of pups in PBSgroup and LPSgroup.The scale bar=50 μm.Mean±SD.n=4.**P＜0.01 vs PBSgroup.图5 不同处理组仔鼠前额叶皮质中TNF-α和IL-10的表达及小胶质细胞分支的观察

表1 妊娠期不同处理仔鼠成年期相关行为学测试Table 1.The associated behavior tests of the pups treated by different challenge during gestation period（Mean±SD.n=14）

Figure 6.The changes of TLR4，iNOSand Arg-1 expression levels in the N9 cells induced by LPSafter TAK242 treatment.A：the mRNA levels of TLR4，iNOSand Arg-1 in the N9 cells；B：the immunofluorescence staining of TLR4 in the N9 cells；C：the immunofluorescence observation of iNOSand Arg-1 in the N9 cells.The scale bar=50 μm.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs LPSgroup.图6 TAK 242处理后LPS诱导的N9细胞中TLR4、iNOS及Arg-1表达的变化

小胶质细胞是中枢神经系统中的主要免疫细胞，是中枢神经系统损伤及免疫激活的第一道防御［4］。小胶质细胞参与突触修剪，清除功能异常的突触以保持大脑的正常功能［31］。Rodriguez等［32］的研究显示，ASD患者存在突触修剪错误，小胶质细胞参与了ASD的发病。Morgan等［33］将ASD患者死后大脑用小胶质细胞标志物（IBA-1和HLA-DR）进行免疫染色，观察到ASD患者额叶岛叶及背外侧前额叶皮层、视觉皮层及小脑中被激活的小胶质细胞数量增加，同时在背外侧前额叶皮层小胶质细胞存在空间结构异常。Edmonson等［34］也观察到在ASD患者前额叶皮质及小脑中存在神经胶质细胞异常激活。这些大量的研究证据表明，小胶质细胞活性与ASD密切相关。小胶质细胞具有巨大的形态和功能可塑性［35］，中枢神经系统中的小胶质细胞被激活后，表现为分支回缩，由高分化的薄胞体转变为分支较少的阿米巴样细胞［36-38］。本研究显示，在具有孤独症样行为的大鼠脑组织中不仅检测到前额叶皮质内IBA-1表达水平显著升高，同时观察到小胶质细胞分支消失，胞体增大、松散，而且PBS对照组的小胶质细胞胞体呈浓缩状态，多向分支丰富明显，进一步表明妊娠期LPS暴露激活了子代大鼠前额叶皮质中的小胶质细胞。被激活的小胶质细胞存在M1和M2两种表型，M1表型是经典的活化类型，可诱导IL-1β、IL-6、TNF-α及iNOS分泌，引起细胞死亡或组织损伤。而M2型包括选择性激活和获得性失活两种状态，前者可分泌IL-4和IL-13，具有抗炎及促进组织修复的作用，后者可摄取凋亡细胞或促进抗炎细胞因子IL-10及TGF-β分泌，减轻急性炎症反应［5］。有趣的是，我们的研究也检测到妊娠期LPS暴露使子代ASD样大鼠前额叶皮质中M1型小胶质细胞标志物iNOS表达显著增加，而M2型小胶质细胞标志物Arg-1表达显著减少，从而导致M1/M2比例失衡，结合LPS组前额叶皮质TNF-α含量升高、IL-10降低的结果，进一步表明妊娠期LPS暴露可导致子代大鼠前额叶皮质小胶质细胞向M1型极化，促进炎性细胞因子分泌，减少抗炎细胞因子产生。

TAK242为TLR4的特异性抑制剂，可下调TLR4下游信号分子MyD88和TRIF的表达［39］。而在体外实验中，我们观察到TAK242预处理可抑制LPS诱导的小胶质细胞向M1型的转变，证明小胶质细胞的分型极化依赖于TLR4信号通路的激活，但TLR4信号通路如何调控小胶质细胞极化的分子机制，还有待于我们今后的深入研究。

综上所述，我们的研究显示，母鼠妊娠期LPS暴露引起的MIA可上调子代前额叶皮质中TLR4表达水平，诱导小胶质细胞异常活化，即向M1型极化，引起M1/M2比例失衡，促进炎性细胞因子分泌，而抗炎性细胞因子减少。这可能是引起子代大鼠产生孤独症样行为的一个致病因素，也为我们下一步研究提供了一定的实验基础。