梁氏情境应激箱对小鼠抑郁样行为的诱导作用

程 涛，张青杰，郑天歌，李云峰，梁建辉

（1.北京大学药学院分子与细胞药理学系，北京 100083；2.军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所，抗毒药物与毒理学国家重点实验室，北京 100850）

抑郁症是最常见的情绪障碍之一，严重影响患者的日常生活。据世界卫生组织报道，目前全球抑郁症患病率4.35%，且呈升高趋势。1991-2001年，美国成年人抑郁症患病率从3.33%上升至7.06%，中国抑郁症的终生患病率也高达6.8%[1-2]。抑郁症确切的病因迄今尚不明确，临床治疗效果不理想，是值得关注和解决的医疗问题。

众所周知，一个新药从化合物发现到临床Ⅲ期试验结束往往需要10余年[3]，且研发成本逐年增高，已由2003年约8亿美元上升至2013年约13亿美元[4-5]。新药研发过程中，临床试验成本最高，风险也最大，可靠的临床前药效学评价可降低药物临床试验失败的风险。动物模型对药效的评价是临床前研究非常重要的一个环节，简单易用、便于观察、稳定可靠的动物模型在抑郁障碍治疗药物的研发中不可或缺。

长期以来，缺乏更好的抑郁模型一直是限制抑郁症相关研究的难题之一。早在21世纪初，建立和开发更好的抑郁动物模型就被推荐为美国精神卫生研究所（National Institute of Mental Health，NIMH）在抑郁症研究领域最优先的发展方向[6]。根据相关理论和原理，目前已开发和建立多种抑郁障碍动物模型，用来研究抑郁的病理生理过程，筛选和评价抗抑郁药物的药理活性，探讨其药理学作用机制。这些动物模型具有各自的优势，同时也存在明显的缺陷。强迫游泳实验和悬尾实验属于经典的行为绝望类抑郁动物模型。此类实验模型存在的问题是刺激过于剧烈，对于较轻度的抑郁敏感性差，且单次给药即可产生抗抑郁样活性，这与临床起效时间并不一致。另外，动物不动状态产生的原因仍存在争议，疲劳、适应或抑郁均有可能导致动物不动状态的出现，甚至有研究人员认为不动时间不能反映动物抑郁样情绪[7]。动物对糖水的饮用存在明显的嗜好，抑郁状态时，动物对糖水甜味的快感缺乏，其嗜好程度明显降低。因此，饮糖偏爱实验主要用来评价动物的抑郁情绪。实验前，动物的饮糖行为需要训练，其饮糖偏爱率并不是非常稳定，经常出现忽高忽低的情况，对后续实验产生不利影响。禁食禁水是饮糖偏爱实验不可缺少的环节，而禁食禁水本身就是一种应激刺激和应激过程，对实验结果可能存在一定的影响。由此可见，已有的、甚至经典的抑郁动物模型存在许多不足和缺陷。近年来，相关抑郁动物模型虽得到了改进和优化，新模型的开发和研究也取得了不少的进展，但仍不能完全满足实际研究工作的需求。因此，建立一种实用的、能克服现有动物模型缺陷的新模型具有非常重要的理论意义和实际应用价值。

WILLNER于1984年首次提出动物模型评价标准的3个方面：表观效度（face validity），结构效度（construct validity）和预测效度（predictive validity）。表观效度是指模型与被模拟的疾病之间现象学的相似性；预测效度是指模型能否正确反映出不同类型治疗药物的临床效应；结构效度是指模型与模拟疾病之间应具有相同的理论基础和发病机制[8]。一个好的动物模型应在具备上述3个效度的同时，尽可能简单易用、便于观察、稳定可靠和信度良好。

本研究根据情境应激的相关理论设计一种新型情境应激箱，即梁氏情境应激箱（Liang's contextual-stress box，Liang's box），2019年7月19日已获得中国发明专利授权（专利号：ZL2016 1 0274546.5，授权公告号：CN107334768 B）。本课题组前期研究结果表明，梁氏情境应激箱具有良好的预测效度[9]。在此基础上，拟采用公认的经典抑郁评价指标研究梁氏情境应激箱对小鼠抑郁情绪的诱导作用，分析和探讨其表观效度。

1 材料与方法

1.1 动物

雄性ICR，KM和C57BL/6J小鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司），生产许可证号：SCXK（京）2016-0006，体质量20～28 g。饲养温度21～23℃，湿度30%～50%，光照保持12 h昼夜节律（8∶00-20∶00）。小鼠分笼饲养，每笼4只，自由摄食进水。实验前，在动物房适应环境3～7 d，期间实验者定时与小鼠接触以消除应激反应。

1.2 行为分析仪器和情境应激箱

SMART 3.0行为分析仪由Panlab公司研发，用于动物行为学实验的数据检测和分析，能捕捉动物的活动轨迹、各区域之间的停留时间、穿梭次数和活动度等数据。

本研究设置4种情境应激环境，包括梁氏情境应激箱、三角形箱、正方形箱和饲养鼠笼。梁氏情境应激箱的底面由1个圆形中央区（直径30 cm）和3个矩形外周臂（25 cm×15 cm）组成，外周臂成相等的夹角与中央区相连，箱体侧壁高25 cm。三角形箱底面为边长64 cm的等边三角形，箱体侧壁高25 cm。正方形箱底面为边长43 cm的正方形，箱体侧壁高25 cm。饲养鼠笼长27 cm，宽20 cm，高15 cm，内放垫料，模拟小鼠日常生活环境。梁氏情境应激箱、三角形箱、正方形箱和饲养鼠笼的底面积分别是 1771 cm2，1774 cm2，1764 cm2和540 cm2（图1）。

实验室保持恒温（21～23℃）恒湿（30%～50%），光照度与饲养环境保持一致（70 lux），各评价实验的光照度按具体实验要求设定，如无特别要求则保持与饲养环境的光照度一致，以减少光照度带来的应激对动物的影响。本研究中实验均在13∶00～次日8∶00之间进行，实验开始前1 h将动物移至实验室适应环境。

1.3 饮糖偏爱实验（sucrose preference test，SPT）

SPT是经典的抑郁评价实验，模拟抑郁症患者的快感缺失，抑郁小鼠表现为饮糖偏爱率降低。实验开始前3～5 d，小鼠单笼饲养，给予纯水和0.8%糖水各1瓶培养饮糖习惯，若饮糖不稳定则适当延长训练时间。正式实验开始前24 h禁食水，食物和双瓶事先称重待用。将小鼠随机分为4组，分别放入饲养鼠笼、梁氏情境应激箱、正方形箱和三角形箱，自由探索15 min后，快速取出小鼠放回原饲养笼中给予食物和双瓶，令其自由摄食进水1 h，期间30 min时交换双瓶位置以排除干扰[10-11]。饮糖结束后，双瓶称重，计算饮糖偏爱率。饮糖偏爱率（%）=饮糖量/（饮糖量+饮水量）×100%。上述情境应激和饮糖步骤重复3次，每次间隔时间为3 d。

Fig.1 Photos of Liang's box（A），triangle box（B），square box（C），and homecage（D）.

1.4 社交行为实验（social interaction test，SlT）

小鼠天性喜好群居和探索新事物，抑郁小鼠表现出低社会交往率，因此，SIT可用来评价小鼠的抑郁情绪。该实验在边长为45 cm×45 cm的旷场中进行。本研究根据文献[12]报道的实验方法稍作改进，具体方法如下：将2个圆柱形笔筒倒扣在社交接触旷场的两对角，其中一个笔筒中放入一只与实验鼠同品系的陌生鼠，实验装置放在摄像机下方，采用Smart 3.0行为分析仪进行图像采集与分析。将小鼠随机分为4组，分别放入饲养鼠笼、梁氏情境应激箱、正方形箱和三角形箱，自由探索15 min后，立即将小鼠从与2个笔筒等距离的对角处放入社交接触旷场，同时开始记录小鼠5 min内与2个笔筒接触的情况，小鼠与笔筒距离＜2 cm判定为接触。每2只小鼠之间需清理实验箱体中的粪便和尿液，并用75%乙醇擦拭箱体内部去除残留气味。实验结束后，统计小鼠在接触区停留时间、空笼区停留时间和在区域间的穿梭次数。社会交往率（%）=接触区停留时间（/接触区停留时间+空笼区停留时间）×100%。

1.5 新奇抑制摄食实验（novelty-suppressed feeding test，NSFT）

NSFT用来评价小鼠的抑郁情绪，抑郁小鼠表现为进食潜伏期延长。本实验根据文献[13]报道的方法和程序在正方形旷场箱（60 cm×60 cm×30 cm）中进行。为适应Smart 3.0行为分析仪采集和记录小鼠进食潜伏期，将一粒鼠粮放在卫生纸（约10.5 cm×13.5 cm）上并放入旷场中央，按卫生纸大小设定鼠粮接触区。

实验前，小鼠禁食12 h。实验当日准备鼠笼和水瓶，称重鼠粮。将小鼠随机分为4组，分别放入饲养鼠笼、梁氏情境应激箱、正方形箱和三角形箱，自由探索15 min后，立即取出小鼠，从旷场底边中间位置放入旷场箱，采用Smart 3.0行为分析仪记录小鼠第一次进入鼠粮接触区所需的时间，即摄食潜伏期。然后，将小鼠拿出，放入事先准备好的鼠笼中自由进食，称量和记录5 min进食量。每2只小鼠之间需清理实验箱体中的粪便和尿液，并用75%乙醇擦拭箱体内部去除残留气味。

1.6 强迫游泳实验（forced swim test，FST）

FST用于评价小鼠的抑郁情绪，是经典的行为绝望模型，抑郁小鼠在强迫游泳时表现出更长的不动时间。实验时将4个2000 mL烧杯置于摄像头前，以黑色幕布为背景，每个烧杯之间用黑色挡板隔开，避免小鼠彼此干扰，烧杯中水深10 cm，水温（25±1）℃[14-15]。将小鼠随机分为4组，分别放入饲养鼠笼、梁氏情境应激箱、正方形箱和三角形箱，自由探索15 min后，而后放入烧杯中进行强迫游泳6 min，并用Smart 3.0行为分析仪记录后4 min内小鼠的不动时间。在Smart 3.0软件中，小鼠不动行为判定的标准和参数设定为：小鼠活动度＜10 cm2·s-1，即小鼠停止游泳（在水中四处游动）和攀爬（前爪划动水面，碰触缸壁），四肢偶尔划动以保持身体不至于下沉，头露水面，处于漂浮状态。每2只小鼠之间需清理烧杯中的粪便，并换水。

1.7 统计学分析

实验结果数据均以±s表示，使用SPSS19.0统计软件进行分析。组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05为具有统计学差异。

2 结果

2.1 饲养鼠笼与梁氏情境应激箱对小鼠抑郁样行为诱导作用比较

实验结果（图2A）显示，与饲养鼠笼组相比，无论是给予1次还是2次梁氏情境应激，ICR小鼠饮糖偏爱率均明显下降（1次梁氏情境应激：df=26，t=-2.352，P=0.027；2次梁氏情境应激：df=26，t=-2.535，P=0.019）。施加3次梁氏情境应激后，ICR小鼠饮糖偏爱率的降低虽并未达到显著性差异，但存在下降的趋势。与饲养鼠笼组相比，梁氏情境应激箱组的ICR小鼠饮糖偏爱率下降达到17.61%。与饲养鼠笼组相比，梁氏情境应激箱的应激刺激明显降低ICR小鼠（图2B：df=22，t=2.986，P=0.008）、KM小鼠（图2C：df=14，t=-2.408，P=0.030）和C57BL/6J小鼠（图2D：df=14，t=-3.561，P=0.003）的社会交往率。饲养鼠笼组与梁氏情境应激箱组ICR小鼠新环境摄食潜伏期分别为34±35和（33±26）s，2组间无显著差异（df=26，t=-0.043，P=0.966）。FST实验中，2组的不动时间分别为163±37和（173±45）s，亦无显著差异（df=28，t=0.703，P=0.488）。

2.2 正方形箱与梁氏情境应激箱对小鼠抑郁样行为诱导作用比较

Fig.2 Effect of homecage and Liang's box treatment on depression-like behaviors in mice.A：sucrose preference rate；BD was the social interaction rate in ICR，KM and C57BL/6J mice，respectively；E：latency to feeding；F：duration of immobility.Mice were placed individually into homecage or Liang's box and allowed to explore freely for 15 min.Then,parameters relative to depression-like behaviors were measured.±s，n=8-14.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with homecage.

实验结果如（图3）所示，在SPT中（图3A），与正方形箱相比，第1次应激后，梁氏情境应激箱组小鼠的饮糖偏爱率明显下降（df=26，t=-2.074，P=0.048）；第2次应激后，梁氏情境应激箱组小鼠的饮糖偏爱率下降16.01%，下降趋势明显；第3次应激后，梁氏情境应激箱组小鼠的饮糖偏爱率显著下降（df=26，t=-2.267，P=0.037）。在SIT中，同时观察了梁氏情境应激箱应激作用对ICR，KM和C57BL/6J小鼠社交行为的影响，以判断梁氏情境应激箱对小鼠的刺激作用是否存在种属差异。与正方形箱相比，梁氏情境应激箱组的ICR小鼠（图3B，df=22，t=-2.013，P=0.030）和C57BL/6J小鼠社会交往率（图3D，df=14，t=-3.751，P=0.002）均明显下降，KM小鼠社会交往率下降虽未达到显著差异，但梁氏情境应激箱组小鼠社会交往率仅为48.37%，较正方形箱组（67.36%）有下降趋势（图3C，df=14，t=-1.993，P=0.066）。如图3E和4F所示，正方形箱组和梁氏情境应激箱组ICR小鼠摄食潜伏期（df=25，t=-1.155，P=0.259）和不动时间（df=28，t=1.702，P=0.100）均未出现显著性差异。

2.3 三角形箱与梁氏情境应激箱对小鼠抑郁样行为诱导作用比较

三角形箱与梁氏情境应激箱作为情境应激刺激对小鼠饮糖偏爱率的影响如图4A所示，第1次应激后，梁氏情境应激箱对小鼠饮糖偏爱率的抑制作用虽未能达到显著性差异（df=26，t=-1.736，P=0.094），但与三角形箱组相比，饮糖偏爱率降低了21.02%；后2次应激后，梁氏情境应激箱组小鼠饮糖偏爱率显著下降（df=26，t=-2.415，P=0.025和df=26，t=-2.554，P=0.021）。图4B-D所示，在社交实验中,与三角形箱相比，梁氏情境应激箱组ICR小鼠社会交往率（df=22，t=-2.348，P=0.028）和C57BL/6J小鼠社会交往率（df=14，t=-3.770，P=0.002）均明显下降。KM小鼠社会交往率的变化虽无显著性差异（df=14，t=-1.570，P=0.139），但下降幅度达到24.26%，下降趋势明显。与三角形箱组相比，梁氏情境应激箱组ICR小鼠摄食潜伏期（图4E，df=26，t=0.823，P=0.418）和不动时间（图4F，df=28，t=-0.788，P=0.437）虽未见显著性差异，但存在一定的增加趋势。

Fig.3 Effect of square box and Liang′s box treatment on depression-like behaviors in mice.A：sucrose preference rate；B-D was the social interaction rate in ICR，KM and C57BL/6J mice，respectively；E：latency to feeding；F：duration of immobility.Mice were placed individually into square box or Liang's box and allowed to explore freely for 15 min.Then,parameters relative to depression-like behaviors were measured.±s，n=8-14.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with square box group.

Fig.4 Effect of triangle box and Liang's box treatment on depression-like behaviors in mice.A：sucrose preference rate；B-D was the social interaction rate in ICR，KM and C57BL/6J mice，respectively；E：latency to feeding；F：duration of immobility.Mice were placed individually into triangle box or Liang's box and allowed to explore freely for 15 min.Then,parameters relative to depression-like behaviors were measured.±s，n=8-14.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with triangle box.

3 讨论

应激的概念首先由加拿大生理学家塞里（SELYE G）提出，是指机体在各种躯体、心理和社会文化等内外因素刺激下所出现的全身性非特异性适应性反应，包括生理和精神两方面。严重的应激刺激可诱发心理问题或精神疾病，尤其是抑郁、焦虑等情绪障碍。人或动物对某些高危的环境、新异的场景、奇特的氛围以及陌生的情景等均可产生应激反应。这种由特定的场景、环境、情景或事件所诱发的生理和心理反应称之为情境应激（contextual-stress）。本课题组设计和构建了一个特定的实验情景和环境，即梁氏情境应激箱，观察和评价此种情境应激刺激对小鼠特征性行为的影响，并对相关行为指标的表征和意义进行分析和解读。前期初步研究结果显示，抗抑郁剂米安色林（mianserine）对相关行为观察指标具有明确的干预作用，表明梁氏情境应激箱预测效度良好[9]。为进一步研究梁氏情境应激箱诱导小鼠抑郁样行为的表观效度，选用SPT，SIT，NSFT和FST 4种经典的抑郁行为评价方法，观察和研究梁氏情境应激箱对小鼠抑郁样行为的诱导作用。

本研究设定饲养鼠笼、三角形箱和正方形箱3种情境应激环境作为对照组，以确定梁氏情境应激箱对小鼠抑郁样行为诱导作用的特异性。值得强调的是，正方形箱、三角形箱和梁氏情境应激箱的面积相等，材料相同，且相关实验程序，实验时间以及实验环境（室温、光照、噪声）均受到严格控制。因此，相应的实验数据具有较好的可比性。饲养鼠笼的面积（540 cm2）虽比梁氏情境应激箱小3.28倍，但作为小鼠的常规饲养环境，有必要将其设定为对照组之一。

小鼠SPT可模拟临床抑郁症患者的快感缺失，对相关事物缺乏必要的兴趣。小鼠饮糖偏爱率降低属于典型的抑郁样行为表现，是评价情境应激诱导抑郁情绪的一个重要指标[16]。本研究结果显示，作为一个特定的应激环境，梁氏情境应激箱处理明显抑制小鼠的饮糖行为，与饲养鼠笼、正方形箱和三角形箱3个应激环境相比较，小鼠饮糖偏爱率分别下降25.90%，24.46%和21.02%。经过3次反复应激实验，与饲养鼠笼、正方形箱和三角形箱相比较，梁氏情境应激箱仍然可明显降低小鼠饮糖偏爱率，分别下降17.61%，18.11%和20.24%，提示梁氏情境应激箱对抑郁样行为的诱导作用比较稳定，重复性较好。虽只进行3次重复应激实验，但初步研究结果显示，小鼠对梁氏情境应激箱所产生的应激反应未见明显的耐受性。

临床上，抑郁症患者常常表现情绪低落、无价值感、社交活动减少，甚至离群索居，逃避与人接触，完全拒绝与社会的联系[17]。小鼠喜好群居和探索新事物，而情境应激可能抑制小鼠探索行为能力，增加社会逃避行为。SIT结果表明，与饲养鼠笼、正方形箱和三角形箱相比较，梁氏情境应激箱明显减少ICR，KM和C57BL/6J小鼠的社会交往率，其中ICR小鼠分别减少36.68%，34.49%和38.10%；KM小鼠分别减少30.65%，28.19%和24.26%；C57BL/6J小鼠分别减少37.98%，39.72%和41.01%。进一步数据分析发现，在SIT中，梁氏情境应激箱对ICR，KM和C57BL/6J小鼠区域间穿梭次数并无明显影响（数据未显示）。上述研究结果表明，①某些实验结果的差异虽并无显著性，但其社会交往率存在明显减少的趋势。因此，从整个研究结果来看，SIT的数据支持小鼠SPT的结果，梁氏情境应激箱对小鼠抑郁样行为具有明显和稳定的诱导作用；②ICR和KM小鼠为远交系，C57BL/6J小鼠属于近交系[18]，尽管三者品系不一样，某些行为反应和特点存在区别，但在SIT中，3种不同品系小鼠的数据得到比较一致的印证。说明梁氏情境应激箱处理对动物抑郁样行为的诱导作用存在一定的品系普适性。

NSFT主要模拟抑郁症患者进食动机和欲望减退的临床表现，通过测定禁食禁水12 h小鼠在新环境中进食的潜伏期，观察和分析动物对食物的渴求以及进食欲望与动机[19]。文献资料表明，摄食潜伏期与动物的抑郁情绪关系密切，抑郁情绪严重者，其进食潜伏期明显延长[19]。在NSFT中，食物放置在明亮空旷的旷场中央，这样的设计可造成进食欲望与中央旷场恐惧的冲突。因此，小鼠NSFT属于一种复合型应激模型[20]。本实验结果显示，与饲养鼠笼、正方形箱和三角形箱相比，梁氏情境应激箱对小鼠摄食潜伏期的影响并无明显差异。其可能的原因是，NSFT通常用于评价慢性应激及抗抑郁药物的治疗作用[19]，而本研究的实验设计属于急性应激程序，作为情境应激刺激，小鼠在梁氏情境应激箱仅停留15 min。因此，梁氏情境应激箱能否作为长期情境应激刺激诱导小鼠的抑郁样行为需要进一步研究。从表观推测，急性禁食禁水所产生应激反应的强度可能高于梁氏情境应激箱，因此并不能完全排除在NSFT过程中急性禁食禁水所产生的强烈的应激反应对实验结果的干扰。

悲观、绝望、遇到问题和困难时缺乏进取精神和积极解决问题的能力是抑郁症患者典型的临床症状[21]。在小鼠FST中，不动时间用来衡量动物的行为绝望，评价抑郁情绪[22]。在FST中，与饲养鼠笼、正方形箱和三角形箱相比，梁氏情境应激箱对小鼠强迫游泳不动时间的影响虽均未达到统计学上的显著性，但存在一定的延长趋势，其延长百分比分别为6.56%，22.79%和10.54%。而且，与饲养鼠笼、正方形箱和三角形箱相比较，梁氏情境应激箱对小鼠不动时间的延长趋势呈现较好的一致性。与NSFT相似，强迫游泳诱导应激反应的程度高于梁氏情境应激箱。因此，在高强度的应激刺激背景下，相对温和的应激刺激能否显现明确的应激诱导作用值得商榷和研究。

综合分析实验结果可得出如下结论：①无论是与饲养鼠笼相比较，还是与正方形箱和三角形箱相比较，梁氏情境应激箱均可显著降低小鼠的饮糖偏爱率与社会交往行为，提示梁氏情境应激箱对小鼠的抑郁样行为存在明确的诱导作用，表现为小鼠的快感缺失和社交回避行为；②梁氏情境应激箱重复应激刺激3次均能降低小鼠饮糖偏爱率，提示小鼠对梁氏情境应激箱诱导的应激反应可能不产生明显的耐受性；③梁氏情境应激箱对不同品系小鼠（ICR、KM和C57BL6J小鼠）的社会交往率均具有明显的抑制作用，说明梁氏情境应激箱对小鼠抑郁样行为的诱导作用可能不存在品系差异性，具有较好的普适性和重复性。由此可见，梁氏情境应激箱诱导小鼠抑郁样行为表征与经典的抑郁动物模型一致性高，表观效度良好。因此，作为情境应激刺激，梁氏情境应激箱诱导小鼠抑郁样行为不仅是一个值得关注的、与临床抑郁症相关的全新动物模型，也可能成为一种筛选和评价药物抗抑郁作用的新的实验方法。