沉默己糖激酶结构域蛋白1表达对胃癌细胞增殖、侵袭、转移和上皮间充质转化的影响

张作艳，吴林文，马家思，郑珊珊，何 镭，张 翀，曾玲晖

（浙江大学城市学院医学院，浙江 杭州 310015）

胃癌是我国发病率和致死率较高的恶性肿瘤，手术切除后复发和转移是影响胃癌患者生存和预后的主要因素[1]。因此，探寻参与胃癌转移的关键分子具有重要的意义。己糖激酶结构域蛋白1（hexokinase domain-containing protein 1，HKDC1）是目前发现的第5种己糖激酶，在人体中具有调节葡萄糖稳态的作用[2-3]。肝中的HKDC1在糖代谢、胰岛素敏感性和孕期营养平衡等方面均发挥了重要作用，HKDC1过表达可改善全身葡萄糖耐量，增强肝和外周胰岛素敏感性[4]。虽然目前对于HKDC1与肿瘤发生发展的具体作用机制尚不明确，但是有文献报道，通过一种基于计算的抗癌活性富集分析方法发现，HKDC1有望成为肺癌治疗的一个全新药物治疗靶点[5]。另有文献报道，HKDC1在肝癌组织中过度表达，沉默HKDC1能够抑制Wnt/β-连环蛋白信号传递抑制肝癌细胞的增殖和迁移，高表达HKDC1与肝癌患者不良预后密切相关[6]。然而，HKDC1在胃癌发生发展中的作用及机制尚不明确，本研究探讨沉默HKDC1的表达与胃癌转移和上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的关系。

1 材料与方法

1.1 细胞和试剂

人胃癌细胞（NCI-N87，BGC-823和HGC-27）均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。磺酰罗丹明 B（sulforhodamine B，SRB）染料购自美国Sigma-Aldrich公司；一抗：兔抗人HKDC1单抗（ab228729）购自美国Abcam公司，兔抗人E-钙黏蛋白单抗（3195P）、小鼠抗人N-钙黏蛋白单抗（14215S）和兔抗人Snail单抗（3879S）购自美国CST生物技术公司，兔抗人GAPDH单抗（sc-25778）购自美国Santa公司；二抗：辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠IgG抗体（71039511）和山羊抗兔IgG抗体（A80400644）购自杭州联科生物技术股份有限公司；jetPRIME（114-15）转染试剂购自法国Polyplus Transfection SA公司；Gluta-MAX™谷氨酰胺培养基及添加剂（35050061）和丙酮酸钠溶液（11360070）购自美国Gibco公司；siRNA购自 上 海 吉玛基因。 Transwell小 室（8 μm，6297045）购自美国Corning公司；CO2恒温细胞培养箱购自美国Thermo公司；SW-CJ-2J超净工作台购自苏州安泰空气技术有限公司；GZX-DH-40×45型倒置显微镜购自德国Leica公司；iCycle实时定量PCR系统、电泳仪和凝胶成像分析系统购自美国Bio-Rad公司。

1.2 细胞培养

将BGC-823和HGC-27细胞接种于RPMI 1640完全培养基（含青霉素100 kU·L-1，链霉素0.1 g·L-1，10%胎牛血清），NCI-N87接种于RPMI 1640完全培养基（含青霉素100 kU·L-1，链霉素0.1 g·L-1，10%胎牛血清，1%GlutaMAX™谷氨酰胺培养基及添加剂、1 mmol·L-1丙酮酸钠溶液）置于37℃，5%CO2恒温培养箱中培养。

1.3 HKDC1 siRNA序列的筛选和转染

根据siRNA的设计原则以及GenBank中的HKDC1的基因序列，设计出具有特异性的针对HKDC1的干扰序列小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）-1和siRNA-2，以及与HKDC1序列无同源性的阴性对照siRNA（negative control siRNA，siRNA-NC）。该序列设计由上海吉玛公司完成。HKDC1 siRNA-1序列为5'-CCAACGCCCAAUGAAAUCATT-3，HKDC1 siRNA-2序列为 5'-GAGCUUGUCAGGCUUAUCUTT-3'，阴性对照siRNA序列为5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'。

取对数生长期的胃癌细胞NCI-N87，BGC-823和HGC-27，按照每孔1.5×105细胞种入6孔板，过夜，待细胞生长至30%～40%融合度时进行转染，将siRNA 4 μL加入jetPRIME 缓冲液200 μL中，温和混匀，室温孵育5 min，加入jetPRIME rejent试剂4 μL；再次温和混匀，室温孵育15～20 min。弃6孔板中培养液，用Opti-MEM洗1遍，每孔加入800 μL无双抗的Opti-MEM，并同时将混合好的含有siRNA的200 μL试剂加入6孔板中，4 h后补加入含20%血清的培养液1 mL。转染24 h后获得NCI-N87-siRNA-NC，NCI-N87-siRNA-1和NCI-N87-siRNA-2细胞，BGC-823-siRNA-NC，BGC-823-siRNA-1和BGC-823-siRNA-2细胞，HGC-27-siRNA-NC，HGC-27-siRNA-1和HGC-27-siRNA-2细胞。

1.4 siRNA对HKDC1表达的抑制

转染24 h后收集细胞，用RIPA裂解液在冰上裂解30 min，4℃，13 000×g离心30 min后，BCA法测定总蛋白浓度后进行Western印迹实验，检测siRNA对HKDC1表达的抑制效果，并计算抑制率。用Image J软件对蛋白条带进行积分吸光度（integrated absorbance，IA）分析，蛋白相对表达水平用IA目标蛋白/IA内参蛋白比值表示。HKDC1抑制率（%）=（阴性对照组HKDC1蛋白表达-沉默组HKDC1蛋白表达）/阴性对照组HKDC1蛋白表达×100%。

1.5 SRB染色法测定细胞存活率

将转染24 h后的胃癌细胞经胰酶消化，按每孔6×104细胞接种于96孔板，再孵育72 h后，弃上清，每孔加入100 μL三氯乙酸固定，4℃冰箱放置过夜，去离子水冲洗5遍后烘干，每孔加入0.4%（m/V）SRB染液50 μL，避光染色20 min，1%冰醋酸洗涤5遍后，烘干，加入三羟甲基氨基甲烷碱液100 μL，轻拍混匀，使用酶标仪测定540 nm处的吸光度A540nm，并计算细胞存活率。实验重复3次。细胞存活率（%）=（转染组A540nm-空白对照组A540nm）/（阴性对照组A540nm-空白对照组A540nm）×100%。

1.6 Transwell法检测细胞迁移能力

将HGC-27-siRNA-NC，HGC-27-siRNA-1和HGC-27-siRNA-2细胞和NCI-N87-siRNA-NC，NCI-N87-siRNA-1和NCI-N87-siRNA-2细胞以每孔8×104细胞，BGC-823-siRNA-NC，BGC-823-siRNA-1和BGC-823-siRNA-2细胞以每孔1×105细胞接种于无血清的200 μL培养基的Transwell小室上室，下室加入500 μL 20%胎牛血清培养基，置于37℃孵箱中常规培养24 h，取出后用1%甲紫甲醇溶液固定染色30 min，用棉棒清除上室未穿过细胞，PBS洗涤后随机选取5个视野，显微镜下拍照，进行细胞计数，比较细胞迁移能力。

1.7 Transwell法检测细胞侵袭能力

将0.5%的基质胶按照每孔100 μL加入Transwell上室，37℃培养箱放置30 min后，取出吸取残余液体，备用。将HGC-27-siRNA-NC，HGC-27-siRNA-1和HGC-27-siRNA-2细胞和NCI-N87-siRNA-NC，NCI-N87-siRNA-1和NCI-N87-siRNA-2细胞以每孔1×105细胞，BGC-823-siRNA-1和BGC-823-siRNA-2细胞以每孔1.2×105细胞接种于无血清的200 μL培养基的Transwell小室上室，下室加入500 μL 20%胎牛血清培养基，置于37℃孵箱中常规培养24 h，取出后用1%甲紫甲醇溶液固定染色30 min，用棉棒清除上室细胞，PBS洗涤后，显微镜下拍照，进行细胞计数，比较细胞侵袭能力。

1.8 Western印迹法检测HKDC1蛋白和EMT相关蛋白表达

收集转染24 h后的胃癌细胞，用RIPA裂解液在冰上裂解30 min，4℃，13 000×g离心30 min后，BCA法测定总蛋白：SDS-PAGE凝胶电泳后，转膜，封闭 1 h，加一抗 4℃孵育过夜（HKDC1：1∶1000；E-钙黏蛋白：1∶1000；N-钙黏蛋白：1∶1000 ；Snail：1∶1000；GAPDH：1∶500）。回收一抗，PBS清洗3次后加二抗（HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体1：5000；HRP标记的山羊抗兔IgG抗体1∶5000），室温孵育1 h后曝光。用Image J软件对蛋白条带进行IA分析。待测蛋白相对表达水平用IA目标蛋白/IA内参蛋白比值表示。

1.9 统计学分析

实验结果数据以±s表示。采用SPSS 22.0软件，各组间的比较采用单因素方差分析（oneway ANOVA），组间两两比较采用Studentt检验。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 siRNA对HKDC1表达的抑制效果

Western印迹结果显示（图1），转染siRNA-1和siRNA-2后，与siRNA-NC组相比，3种细胞HKDC1蛋白表达降低（P＜0.05，P＜0.01）。对NCI-N87-siRNA-1和NCI-N87-siRNA-2细胞的抑制率分别为（20.5±0.1）%和（48.6±0.1）%，BGC-823-siRNA-1和BGC-823-siRNA-2细胞分别为（56.5±0.1）%和（58.9±0.1）%，HGC-27-siRNA-1和HGC-27-siRNA-2细胞分别为（63.5±0.1）%和（85.9±0.1）%。

Fig.1 Silence effect of siRNA on expression of hexokinase domain containing 1（HKDC1）protein in NCl-N87，BGC-823 and HGC-27 cells by Western blotting.Gastric cancer cells were transfected by negative control siRNA（siRNA-NC），HKDC1 siRNA-1（siRNA-1）and HKDC1 siRNA-2（siRNA-2）for 24 h，Western blotting was used to detect the expression of HKDC1.B was the semi-quantitative result of A.IA：integrated absorbance.±s，n=3. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with siRNA-NC group.

2.2 沉默HKDC1表达对胃癌细胞增殖的影响

由图2显示，与对应的siRNA-NC组细胞相比，NCI-N87-siRNA-1和NCI-N87-siRNA-2细胞的存活率降低（P＜0.01），BGC-823-siRNA-1，BGC-823-siRNA-2，HGC-27-siRNA-1和HGC-27-siRNA-2细胞的存活率也均显著低于siRNA-NC组（P＜0.05，P＜0.01），提示沉默HKDC1表达可显著抑制胃癌细胞增殖。

Fig.2 Effect of silence HKDC1 on cell viability of NCl-N87，BGC-823 and HGC-27 cells transfected by siRNA.See Fig.1 for the cell transfection.The cells transfected by siRNA were incubated for 72 h and the SRB assay was used to detect the cell viability.Cell viability（%）=（A540 nmof siRNA group-A540 nmof blankgroup）/（A540 nmof siRNA-NCgroup-A540 nmof blank group）×100%.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with siRNA-NC group.

2.3 沉默HKDC1表达对胃癌细胞迁移能力的影响

Transwell实验结果显示（图3），转染siRNA-1和siRNA-2后，3种细胞在Transwell小室内培养24 h后，细胞的迁移数如图3B所示。与对应siRNA-NC组相比，转染siRNA-1和siRNA-2细胞体外迁移能力显著降低（P＜0.01），表明沉默HKDC1表达可抑制胃癌细胞迁移。

2.4 沉默HKDC1表达对胃癌细胞侵袭能力的影响

Transwell侵袭实验结果如图（图4），转染siRNA-1和siRNA-2后，3种细胞在Transwell小室内培养24 h，细胞的侵袭数如图4B所示。与对应siRNA-NC组相比，转染siRNA-1和siRNA-2细胞体外侵袭能力显著降低（P＜0.01），提示沉默HKDC1可抑制胃癌细胞体外侵袭能力。

2.5 沉默HKDC1表达对EMT相关蛋白表达的影响

Western印迹结果（图5）显示，与siRNA-NC相比，分别转染siRNA-1和siRNA-2 24 h后，3种细胞E-钙黏蛋白表达显著增加（P＜0.05，P＜0.01）；N-钙黏蛋白表达显著降低（P＜0.05，P＜0.01）；Snail蛋白表达在NCI-N87和BGC-823细胞中显著下降（P＜0.01）；而在HGC-27细胞中，仅转染siRNA-2的细胞表达显著降低（P＜0.05）。

Fig.3 Effect of silence HKDC1 on migration of NCl-N87，BGC-823 and HGC-27 cells transfected by siRNA.See Fig.1 for the cell transfection.The cells were cultured in Transwell for 24 h.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with siRNA-NC group.

Fig.4 Effect of silence HKDC1 on invasion of NCl-N87，BGC-823 and HGC-27 cells transfected by siRNA.See Fig.1 for the cell transfection.The cells were cultured in Transwell for 24 h.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with siRNA-NC group.

Fig.5 Effect of silence HKDC1 on protein expressions of E-cadherin，N-cadherin and Snail in NCl-N87，BGC-823 and HGC-27 cells transfected by siRNA by Western blotting.See Fig.1 for the cell transfection.B was the semiquantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with siRNA-NC group.

3 讨论

胃癌是全球第五大最常被诊断的癌症，也是第三大与癌症死亡相关原因，胃癌患者的5年生存率仅为26%[7-8]。前期临床TCGA数据库挖掘发现，HKDC1在胃癌肿瘤组织中高表达，且HKDC1高表达患者较低表达患者预后更差，进一步提示HKDC1可能参与了胃癌的发生发展。本研究首先利用siRNA沉默HKDC1表达，发现siRNA-1和siRNA-2均能够特异性抑制HKDC1的表达。随后发现，转染siRNA-1和siRNA-2后，与siRNA-NC组相比，3种细胞的存活率降低，提示沉默HKDC1表达可显著抑制胃癌细胞的增殖。在前期预实验中发现，转染siRNA-NC对HKDC1表达无影响，与正常对照组细胞无差别，因此本研究中未设细胞对照组。

胃癌复发和高转移是威胁患者生存的重要因素[9]，阐明影响胃癌转移的关键分子将为晚期胃癌治疗提供生物标志物和治疗靶点。本研究用siRNA沉默HKDC1后，检测胃癌细胞体外迁移和侵袭的能力变化，发现与siRNA-NC组相比，3种细胞HKDC1表达被抑制后，体外迁移和侵袭的能力均显著下降，提示靶向沉默HKDC1可能是抑制胃癌转移的有效途径。据报道，HKDC1在乳腺癌细胞和临床乳腺癌肿瘤组织中也存在高表达，沉默HKDC1能够在体内和体外水平抑制乳腺癌细胞的增殖以及肿瘤的生长和转移[10]。因此，靶向HKDC1信号通路可能是抑制肿瘤转移的新型治疗策略。

EMT是指上皮细胞转化为具有间质表型及生物学特性的生物学过程，其异常与肿瘤转移、耐药和肿瘤干细胞特性密切相关。钙黏蛋白是一种钙依赖性的负责调节细胞间黏附作用的跨膜糖蛋白家族[11]。分为10多个亚类，包括EMT重要的标志物E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白和跨膜糖蛋白等[12]。EMT发生过程中，细胞-细胞间黏附的上皮标志物E-钙黏蛋白的表达下调，而间质细胞标志物N-钙黏蛋白、纤黏蛋白（fibronectin）和波形蛋白（vimentin）等表达上调。E-钙黏蛋白参与调节细胞增殖、侵袭和迁移的信号通路，E-钙黏蛋白失调导致胃上皮细胞功能障碍并导致胃癌发展[13]。此外，其表达变化可反映胃黏膜的的病理状态。在胃癌中，可溶性的E-钙黏蛋白可作为胃癌的预后分子标志物[14]和独立的预后因子[15]。本研究结果表明，沉默HKDC1表达能促进E-钙黏蛋白的表达，抑制N-钙黏蛋白的表达，表明HKDC1可能通过抑制EMT影响胃癌细胞的迁移和侵袭能力。转录因子Snail可促进EMT的发生，并在多种肿瘤中呈高表达。Snail高表达的肿瘤组织中，E-钙黏蛋白表达常下降。本研究结果表明，沉默HKDC1表达可以抑制Snail蛋白的表达。但HKDC1如何调控胃癌细胞EMT发生还有待更深入的研究。

综上所述，沉默HKDC1表达后，胃癌细胞增殖、EMT和侵袭运动能力均受到抑制，提示HKDC1可能参与胃癌细胞转移，HKDC1有可能成为胃癌治疗的潜在分子靶点。