小鼠条件性恐惧模型的建立和品系敏感性研究

薛 瑞，魏肇余，张森品，陈红霞，李云峰，张有志

（军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所，抗毒药物与毒理学国家重点实验室，北京 100850）

创伤后应激障碍（post-traumatic stress disorder，PTSD）是指个体经历、目睹或遭遇到一个或多个重大创伤性事件所导致的延迟出现和持续存在的一类精神障碍[1]。1980年，“美国精神疾病诊断与统计手册”第三版（DSM-Ⅲ）首次定义了该疾病和明确了诊断标准，最新出版的DSM-Ⅴ将PTSD从焦虑障碍中分离出来，与急性应激障碍、适应障碍等归入创伤及应激相关障碍分类下[1-2]。流行病学研究表明，创伤事件发生后PTSD的终生患病率为1.3%～12.2%，其中女性发病率高于男性，儿童期遭遇创伤风险高于成人期[2-3]。目前PTSD的治疗以心理干预和药物治疗相结合的方式为主，以舍曲林和氟西汀为代表的5-羟色胺重摄取抑制剂被认为是PTSD治疗的首选用药[4-5]。

PTSD病理机制研究和新药评价依赖于理想的PTSD动物模型，然而由于发病机制复杂，单一模型无法全面模拟其核心症状，因此多采用多模型结合的方式评价疾病和药物的作用特点。PTSD的核心症状群包括创伤事件闯入性回忆、创伤线索回避、高警觉和反应性及认知与情感的负性改变，其中创伤性事件闯入性回忆与恐惧记忆的再现具有相似的过程和表现[2]。条件性恐惧模型被认为是模拟评价创伤事件闯入性回忆的经典模型，此外，它还可评价恐惧记忆不同阶段的特点，为我们精准评价疾病发生和药物作用特点提供了良好的工具。

本研究首先通过预实验对文献方法[6-8]进行改进，建立稳定的小鼠条件性恐惧模型，进而以ICR小鼠、DBA/2小鼠（后简称DBA小鼠）和C57BL/6J小鼠（后简称C57小鼠）为研究对象，通过评价不同品系小鼠在场景恐惧和声音线索恐惧获得与表达的敏感性确定了C57为敏感品系鼠，并对C57小鼠条件性恐惧的自然消退和声音线索恐惧消退训练和保持进行研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物

ICR小鼠和C57小鼠，雄性，SPF级，体质量18～20 g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，实验动物许可证号：SCXK（京）2016-0002。DBA小鼠，雄性，SPF级，体质量18～20 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号：SCXK（京）2016-0006。饲养温度 22～26℃，湿度40%～60%，8∶00-20∶00灯光照明，自由摄食饮水。

1.2 主要仪器

条件性恐惧检测系统：包括条件性恐惧测试箱和Video Freeze SOF-843僵住时间采集软件（美国Med Associates Inc.公司）。

1.3 小鼠条件性恐惧模型的建立

小鼠购入后适应性饲养6 d，实验当天提前1 h放入实验间。不同品系小鼠放入电击箱内（A环境）自由探索2 min（适应期）后，给与30 s声音刺激（85 dB，5000 Hz），后2 s伴随给与不可逃避的足底电击（0.6 mA，持续2 s），声音-电击共配对5次，每次间隔2 min。计算机软件记录各个阶段（包括适应期、5轮声音刺激期和5轮间歇期）的僵住时间，僵住时间百分率（%）=僵住时间（s）/总时间（s）×100%。僵住行为是啮齿类动物表达恐惧的方式，表现为除呼吸运动外全身其余的肌肉运动均消失[9]。

1.4 场景恐惧和声音线索恐惧表达的检测

场景恐惧表达检测：条件性恐惧训练24 h后，将小鼠再次置于接受过电击的装置（环境A：足底电栅栏+白光）中，不给与任何刺激，进行环境重现，记录5 min内的僵住时间，计算僵住时间百分率，评价3种品系小鼠场景条件恐惧表达的特点。

声音线索恐惧表达检测：场景恐惧检测2 h后，将小鼠置于新环境（环境B：三角形半透明黑色套盒+白色底板+无白光）中，2 min适应期后进行30 s声音刺激，声音刺激结束30 s后将动物取出，记录各个阶段（包括适应期、声音刺激期和间歇期）的僵住时间，计算僵住时间百分率，用于评价3种品系小鼠线索条件恐惧表达的特点。

1.5 条件性恐惧的自然消退

以C57小鼠为研究对象，分别于条件性恐惧训练后第2，7，14，21和28天对其场景恐惧和声音线索恐惧进行检测，以评价该品系小鼠条件性恐惧的自然消退特点。其中，场景恐惧检测5 min内僵住时间（环境A，无声音信号，不电击），声音线索恐惧检测30 s声音刺激期内僵住时间（环境B，不电击，2 min适应+30 s声音信号+30 s间歇），计算僵住时间百分率。

1.6 声音线索恐惧消退训练和消退保持测试

以C57小鼠为研究对象，在条件性恐惧训练（方法见1.3）后24 h进行声音线索恐惧消退训练，消退训练结束后24 h进行消退保持测试。消退训练方法：将C57小鼠放入B环境电击箱中，适应2 min后，采用“30 s声音刺激+30 s间歇期”方法给与10次声音刺激，计算机软件记录适应期、10轮声音刺激阶段和10轮间歇期的僵住时间，计算僵住时间百分率，作为消退训练成绩。消退保持测试方法：将C57小鼠放入B环境电击箱中，适应2 min后，给与30 s声音刺激1次，刺激结束30 s后将动物取出，记录不同阶段（适应期+30 s声音刺激期+30 s间歇期）内僵住时间并计算僵住时间百分率，作为消退保持成绩。

1.7 统计分析

实验数据用±s表示，采用Prism8.0软件进行统计。两组间比较采用Studentt或Manny-Whitney检验，多组间比较采用单因素方差分析和Dunnettt或Tukey检验，不同时间点检测僵住时间百分率数据采用重复测量的单因素方差分析。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 3种品系小鼠条件性恐惧获得的差异性

3种品系模型组小鼠随声音/场景-电击配对次数增加均呈现僵住时间百分率增加（图1），其中ICR小鼠末次检测的僵住时间百分率为（29±22）%，DBA小鼠为（35±19）%，C57小鼠为（81±20）%。3种品系正常组小鼠不同时间点僵住时间百分率无明显波动。

2.2 3种品系小鼠条件性恐惧表达的差异性

条件性恐惧训练24 h后，分别进行场景恐惧检测和声音线索恐惧检测，评价不同品系小鼠条件性恐惧表达的差异。ICR，DBA和C57模型组小鼠场景恐惧的僵住时间百分率分别为（8±11）%，（26±20）%和（45±16）%（图2），其中DBA小鼠和C57小鼠模型组与对照组相比有统计学差异（P＜0.05，P＜0.01）。如图3所示，ICR，DBA和C57模型组小鼠在新环境下的僵住时间百分率分别为（2±3）%，（5±5）%和（14±9）%，提示不同品系小鼠在新环境下未呈现恐惧反应。在30 s的声音刺激期，上述3种品系模型组小鼠的僵住时间百分率分别为（13±24）%，（47±26）%和（66±19）%，其中DBA小鼠和C57小鼠模型组与对照组相比有统计学差异（P＜0.05，P＜0.01）。

2.3 C57小鼠条件性恐惧自然消退

分别于条件性恐惧训练第2天（D2）、D7、D14、D21和D28进行5 min场景恐惧和30 s声音线索恐惧检测，评价C57小鼠条件性恐惧自然消退的行为特点。如图4A所示，C57小鼠D2，D7，D14，D21和D28场景恐惧的僵住时间百分率分别为（45±16）%，（25±12）%，（19±8）%，（16±7）%和（25±14）%，其中D2与对照组相比有统计学差异（P＜0.01）。如图4B所示，C57小鼠D2，D7，D14，D21和D28声音线索恐惧的僵住时间百分率分别为（65±21）%，（69±13）%，（52±23）%，（58±31）%和（48±22）%，其中D2，D7，D14，D21与对照组相比有统计学差异（分别为P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05和P＜0.01）。

2.4 C57小鼠声音线索恐惧的消退训练和保持

Fig.1 Fear acquisition performance following fear conditioning training in lCR（A），DBA（B）and C57（C）mice.Different strains of mice were placed in the foot shock box（context A）for 2 min before sound（30 s，85 dB）-shock（2 s，0.6 mA）presentation.Freezing behavior was recorded by computer.Percentage of freezing time（%）=freezing time（s）/total time（s）×100%.n=8-11.±s.

Fig.2 Contextual fear expression in lCR（A），DBA（B）and C57（C）mice 24 h following fear conditioning training.Twenty-four hours following fear conditioning training，different strains of mice were re-placed in the same shock box（context A）again，and freezing behavior was measured for 5 min without sound or shock.±s，n=10.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group.

Fig.3 Tone-cued fear expression in lCR（A），DBA（B）and C57（C）mice 24 h following fear conditioning training.Two hours following contextual fear expression test，different strains of mice were placed in a different context（context B ）for 2 min before 1 trail of 30 s sound-30 s interval.±s，n=10.＊＊P＜0.01，compared with control group.

Fig.4 Time-dependent extinction of contextual fear conditioning（A）and tone-cued fear conditioning（B）in C57 mice.Fear expression behavior in C57 mice was tested in context A and context B for 5 min and 30 s，respectively，in D2，D7，D14，D21 and D28.±s，n=10.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group.

Fig.5 Extinction training（A）and retention test（B）in C57 mice following tone-cued fear conditioning training.C57 mice were subjected to 10 extinction trails with 30 s sound presentation and 30 s intervals in context B.Twenty-four hours later，extinction retention test was performed in the same context for 30 s with sound on.±s，n=10.

条件性恐惧训练24 h后，采用“30 s声音刺激-30 s间歇期”的方法进行10轮声音消退训练，如图5A所示，随消退训练次数增加，C57小鼠声音线索恐惧反应逐渐降低，第1轮和第10轮声音刺激期僵住时间百分率分别为（55±30）%和（32±27）%。消退训练24 h后进行消退保持测试，如图5B所示，C57小鼠在30 s声音刺激期的僵住时间百分率为（47±35）%。

3 讨论

根据与创伤记忆是否具有直接联结，PTSD模型可分为敏化模型和条件性恐惧模型，其中敏化模型包括单程长时应激模型、时间依赖敏化模型、单程短暂电击模型、天敌模型和社会挫败模型等[10-11]。无论是PTSD患者还是敏化动物模型都会出现恐惧反应增敏和（或）消退障碍等症状，因此条件性恐惧模型在PTSD病理机制研究和抗PTSD药物评价中具有重要价值。条件性恐惧模型是基于巴甫洛夫条件反射，以电击刺激为创伤性应激因子，将中性条件性刺激（如应激环境、声音或灯光）和厌恶性的非条件刺激（电击）进行多次配对，动物可获得场景关联恐惧（以环境为线索的恐惧条件化）和（或）声音线索恐惧（以声音为线索的恐惧条件化）[12]。

条件性恐惧模型的建立与多种因素密切相关，如动物品系、电击强度、电击时间、声音刺激时间、声音-电击配对次数、配对方式、预适应方式、间歇期时间和实验目的等。训练过程是恐惧条件化的学习过程，不同实验室采用的造模训练方式不同。由于药物对恐惧行为既可能发挥促进作用也可能发挥抑制作用，因此本研究希望通过训练方案的优化将僵住时间百分率控制在40%～60%。此外，本研究拟在D2同时检测场景和声音线索恐惧的表达，因此恐惧条件化训练时增加了间歇期时间，如仅检测声音线索恐惧的表达，则可缩短适应期和间歇期的时间。在文献调研和预实验的基础上，本研究发现声音-电击配对5次可成功诱导C57小鼠形成场景恐惧和声音线索恐惧，DBA小鼠可诱导形成声音线索恐惧但无法形成场景恐惧，而神经精神药理学研究最常用的远交系小鼠品系ICR小鼠则无法诱导形成场景恐惧和声音线索恐惧，提示动物品系可能对条件性恐惧模型能否成功具有决定性的影响。结合恐惧消退和保持的实验结果，本研究发现C57小鼠为条件性恐惧研究的敏感品系鼠，易形成恐惧反应，声音线索恐惧可持续3～4周。

除训练方式外，不同实验室采用的检测指标和检测方式也不尽相同。僵住行为的检测指标分为僵住时间和僵住次数2种，二者记录方式不同[13-14]。僵住时间是记录检测周期内动物呈现僵住反应的累计时间，而僵住次数则是间隔固定时间（常为6～10 s，与检测周期长短有关）判断一次动物是否处于僵住状态，进而记录累计僵住次数。本研究以小鼠为研究对象，条件性恐惧模型僵住行为研究时采用了计算机软件自动记录僵住时间的方法。但值得注意的是，如以大鼠为研究对象，部分大鼠呼吸幅度较深，可能会影响计算机软件采集数据的准确性，此时建议采用人工记录僵住次数的方式进行数据采集。此外，本研究还对声音线索恐惧的检测方式进行了优化。目前，文献报道的检测场景恐惧采用的时长多为3～11 min，其中以记录5 min内的僵住时间最常见[7，15]，本研究也采用该时长进行场景恐惧的检测。然而对于声音线索恐惧，多数文献中采用检测2或3 min内僵住时间或次数的方法[6-7]，而本研究发现，2 min长时声音刺激时，小鼠发生了时间依赖的恐惧消退，此种方式检测的声音线索恐惧的僵住时间百分率不足30%（结果未列出），因此通过预实验，本研究将声音线索恐惧的检测时间优化为30 s。

此外，值得注意的是，条件性恐惧模型是否成功不应仅以统计学结果作为参照，而应结合研究目的，以僵住时间百分率是否满足实验需求为核心依据。例如，本研究中D2进行的场景恐惧表达检测中，DBA模型小鼠的僵住时间百分率虽与正常组相比显著增加，但DBA模型组僵住时间百分率仅为25%，因此DBA小鼠并非场景恐惧检测的合适品系，模型组25%的僵住率也无法满足检测药物作用的目的。

综上，本研究确定了C57小鼠为敏感品系，建立了恐惧获得、表达、自然消退、消退训练和消退保持各阶段恐惧行为检测的实验方法，成功建立了小鼠条件性恐惧模型，该模型稳定可靠，具有良好的可重复性。