孤独症谱系障碍实验动物模型研究进展

李 燊，吴海涛，2

（1.青岛大学基础医学院，山东 青岛 266071；2.军事科学院军事医学研究院军事认知与脑科学研究所，北京 100850）

孤独症谱系障碍（autism spectrum disorder，ASD）是一种神经发育相关精神疾病，具有复杂的遗传和环境成因。1943年，美国儿童精神病医师KANNER[1]报道了11例ASD患儿的临床症状，成为ASD诊断的重要基础。ASD典型特征主要表现为社会交往障碍和重复刻板样行为，部分ASD患者同时存在智力障碍和癫痫。ASD全球患病率为1.7%[2]，并逐年升高。ASD一旦发病，其症状会伴随终生，对家庭和社会带来沉重的精神和经济负担。现阶段，对于ASD的诊断和治疗仍缺乏行之有效的手段和方法，迫切需要通过深入的发病机制探讨，来探寻其病因及病理生理学进程，为新型临床诊疗和干预措施研发提供理论依据和实验支撑。

目前，关于ASD的生物学研究主要围绕经典的实验动物模型展开。因此，构建稳定可靠的ASD动物模型，对于深入探索ASD发病机制、病理生理进程、行为学变化及诊断治疗等具有至关重要的研究价值。基于不同实验动物模型在ASD研究中的重要性，本综述将重点围绕近年来用于构建ASD的常见模式动物及其构建方法进展进行梳理和总结，以期为ASD相关实验研究提供线索和依据。

1 孤独症谱系障碍研究常用的模式动物

基于模式动物在ASD研究中的重要价值，当前，国内外不同实验室已成功构建了包括非人灵长类、啮齿类、鸣禽、斑马鱼、果蝇、海兔和秀丽隐杆线虫等在内的多种ASD模式动物。

各类模式动物的构建旨在模拟与ASD相关的核心表型，包括社交和沟通障碍、兴趣受限和刻板重复样行为等。并在此基础上，借助各类ASD模式动物在不同层面和维度深入解析ASD发病机制。我们将现有文献报道的常用ASD相关模式动物及其研究优势总结如下（表1）。

2 常见孤独症谱系障碍动物模型构建方法

由于ASD发病机制复杂，需要借助不同方式构建不同类型的ASD动物模型。目前ASD动物模型的构建方法主要分为遗传学方法、化学药物诱发和生物因素诱导3大类。

2.1 基于遗传学方法构建

大多数研究者认为，ASD的病因及发病机制与遗传因素密切相关。随着基因组学研究的迅速发展，借助新型基因测序技术，人们获得了大批ASD相关易感及致病基因。近年来，随着锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶以及CRISPR/Cas9等基因编辑技术的发展，使基因突变动物模型迅速发展。目前热门的突变基因主要包括编码突触黏附蛋白神经配蛋白（neuroligin，NL）基因和神经连接蛋白（neurexin，NR）类基因，Rett综合征MeCP2基因，染色体22q13.3缺失综合征Shank3基因，结节性硬化综合征1（tuberous sclerosis complex 1，Tsc1）和Tsc2基因和脆性X综合征Fmr1基因等（表2）。

表1 实验室常见孤独症谱系障碍（ASD）模式动物类型及其研究优势

2.1.1 神经配蛋白

NL是存在于突触后膜上的细胞黏附分子，与NR相互作用促进突触前膜和后膜的形成。NL-1敲除小鼠和NL-1 P89L敲入小鼠均表现出空间记忆受损。NL-1敲除小鼠显示出强烈的梳理刻板行为表型，而NL-1 P89L杂合子小鼠则未显示异常的刻板梳理行为[14-15]。另外，NL-2敲除小鼠也表现出ASD样行为，其社交行为正常，但焦虑样行为增加，疼痛敏感性降低以及运动协调性差[16]。NL-3缺失小鼠则表现出超声发声受损和社会记忆改变[17]。MODI等[18]发现，NL-3 敲除小鼠表现出明显的社交能力缺陷。 ROTHWELL等[19]报道了NL-3 R451C敲入小鼠具有社交新颖性偏好缺陷、过度活跃和重复行为等ASD相关行为表型。浙江大学罗建红等[20]利用NL-3 R451C敲入小鼠进一步研究发现，前额叶皮质脑区gamma振荡异常可能是导致小鼠社交行为障碍的主要原因，而通过操控前额叶皮质脑区抑制性PV中间神经元可有效逆转NL-3 R451C敲入小鼠的社交缺陷。

HAMILTON等[21]还描述了利用锌指核酸酶基因编辑方法开发的NL-3敲除大鼠模型，这为利用大鼠作为研究ASD相关基因的致病机制提供了重要实验依据。研究发现，NL-3敲除大鼠表现出过度活跃，且对惊恐刺激产生的前脉冲抑制受损，脑电图研究显示，该突变大鼠睡眠中断与ASD患者睡眠障碍症状高度一致[22]。

2.1.2 神经连接蛋白

NR编码α和β神经毒素，并且作为NR的突触前结合配体，在突触的黏附、分化和成熟中具有重要作用。目前较常见的模型鼠来自NR-1α/2α/3α3个基因全部敲除的小鼠，或来自NR-1α/2α双敲小鼠。与野生型小鼠对比，三敲和双敲小鼠分别在脑干和新皮质中显示较少的抑制性突触[23]。

ESCLASSAN等[24]发现，NR-1α敲除大鼠存在显著的非社会性认知缺陷，最显著的行为表型是类似多动症的过度活跃。有趣的是，ASD患者也常表现出注意缺陷多动障碍等并发症。

Cntnap2是另一类neurexin家族成员，目前在患有智力障碍和ASD的个体中可观察到Cntnap2基因的隐性突变或染色体倒位。来自鸣禽的研究表明，Cntnap2与人类ASD有关，且富含与人类语言相关的神经环路。已有报道，Cntnap2突变的小鼠显示行为缺陷、多动以及癫痫发作[25]。

2.1.3 甲基CpG结合蛋白2

甲基CpG结合蛋白2（methyl-CpG binding protein 2，MeCP2）靶向突变的ASD小鼠模型与临床Rett综合征具有高度的表型一致性。许多研究表明，MeCP2突变小鼠表现出社会行为受损。这些模型包含了许多与人类相似的症状，从而为理解ASD行为异常的神经机制提供了有价值的实验体系。

目前，较为经典的MeCP2突变小鼠有缺失外显子3[26]、缺失外显子3和4[27]以及308X点突变[28]。尽管MeCP2敲除小鼠表现出Rett综合征患者存在的大多数发育和行为缺陷，但在MeCP2过表达小鼠模型中难以鉴定出ASD样行为[29]。WU等[30]构建了MeCP2敲除大鼠模型，其表现出生长迟缓、咬合不正、缺乏运动、前肢握力较弱和显著的社会交往缺陷。

表2 常见遗传修饰ASD哺乳类动物模型的构建

中科院上海神经科学研究所仇子龙和孙强等[31]基于慢病毒感染策略，构建了大脑中过表达人类MeCP2的转基因食蟹猴（Macaca fascicularis），其表现出ASD样行为并呈现出转基因的种系稳定遗传。来自同济大学医学院、昆明理工大学等单位的研究人员详细描述了利用转录激活因子样效应物核酸酶技术编辑MeCP2基因的新型MeCP2突变食蟹猴模型[32]。随后，ZHANG等[33]探讨了MeCP2突变猴的相关表型，包括灵长类动物独特的眼动追踪检测，结合磁共振成像分析，发现了同ASD患者相似的生理、行为和结构异常。此类研究表明，使用基因工程方法构建非人灵长类动物模型研究脑部疾病的可行性和可靠性，对于ASD相关神经机制研究以及潜在治疗干预具有重要的研究价值。

2.1.4 SH3和多样锚蛋白重复域蛋白

Shanks是一类突触后密度蛋白，可同多种离子型和代谢型谷氨酸受体相互作用，并与肌动蛋白细胞骨架相联系。Shank3的突变与ASD和Phelan-McDermid综合征有关，其特征包括全脑发育迟缓、智力残疾、言语延迟或缺失和轻微畸形等特征。目前已构建了多种针对Shank3的多种动物模型，Shank3正在成为ASD研究的热点基因。

WANG等[34]描述了ASD相关Shank3基因敲除小鼠模型，发现皮质-纹状体-丘脑环路在突变体中过度活跃，但在社交行为期间活性降低。研究人员还可利用超声发声研究Shank3敲除大鼠的社交沟通行为[35]。MODI等[36]通过利用Shank2敲除大鼠模型，研究发现其表现出显著的ASD行为表型，包括过度活跃、运动增加和重复刻板行为等，其过度活跃的表型可能与纹状体中mGluR1表达上调、树突分支增加和长时程抑制增强有关。LIU等[37]使用CRISPR/Cas9基因编辑方法构建了第一个可遗传的Shank3b突变斑马鱼模型，其表现出明显的ASD样行为和突触蛋白homer1和突触素水平改变。JAMES等[38]在斑马鱼Shank3基因突变模型中验证了肠道运动障碍是由该基因突变所致。

中科院深圳先进院脑认知与脑疾病研究所ZHOU等[39]报道了食蟹猴Shank3的种系可传播突变非人灵长类动物模型。该突变猴表现出明显的睡眠障碍、运动缺陷、重复行为增加及社交和学习障碍等，比啮齿类动物模型更加接近ASD样行为和神经表型。

2.1.5 脆性X智力低下蛋白1

脆性X综合征主要是由脆性X智力低下基因（fragile X mental retardation 1，Fmr1）启动子中胞嘧啶-鸟嘌呤-鸟嘌呤三核苷酸的扩增引起，少数是由点突变引起。男童的临床症状较女童更加严重，包括智力残疾、言语迟缓、焦虑、注意力缺陷障碍、多动、癫痫发作和身体畸形等。

COMERY等[40]描述了Fmr1敲除小鼠大脑皮质神经元树突棘较野生型小鼠更长、细而曲折，且顶树突的树突棘密度更大。HE等[41]通过在体双光子钙成像技术发现，Fmr1突变小鼠的神经元对重复胡须刺激的适应性明显不足，提示皮质感觉回路中适应性受损可能是ASD触觉防御的潜在原因之一。SAXENA等[42]通过穿管实验研究了Fmr1敲除大鼠社会支配地位和社会等级的变化，为理解Fmr1敲除大鼠群体之间复杂的社交动态提供了新见解。

2.1.6 结节性硬化复合物蛋白1/2

Tsc是一种常染色体显性遗传的疾病，其特征是在多个器官（包括脑和肾）中产生块茎样良性肿瘤，甚至发展成恶性肿瘤。NORMAND等[43]研究结果表明，在胚胎后期被缺失丘脑Tsc1，能导致成年小鼠癫痫发作和强迫性梳理等ASD样行为。REITH等[44]描述了与浦肯野细胞相关的Tsc2缺失小鼠模型，该小鼠浦肯野神经元损伤并表现出社交障碍、重复行为和有限的兴趣。由于浦肯野细胞缺失是ASD患者中最常见的解剖异常之一，该模型可为相关病理生理学研究提供实验支撑。

2.1.7 其他基因

有研究提示，多巴胺转运体（dopamine transporter，DAT）突变可能也和ASD的发生密切相关。自然界中存在一种DAT T365M的突变，即DAT肽链的第365位苏氨酸突变为蛋氨酸，在果蝇中，该突变被证实可产生包括运动过度、恐惧、重复动作和社交互动改变等与ASD类似的行为障碍[45]。DICARLO等[46]将该突变引入小鼠中，发现携带DAT T356M基因突变的小鼠表现出社交活动减少、社会支配地位丧失以及埋珠行为减少等行为障碍。

2.2 化学因素诱发

经过数十年的研究，大多数学者认为，多种化学因素所致的脑功能发育障碍可能与ASD关系密切，进而提出了多种发病机制假说。常见的由化学因素诱发的动物模型主要有丙戊酸（valproic acid，VPA）诱发模型、沙利度胺（thalidomide）模型和米索前列醇（misoprostol）模型等。

2.2.1 丙戊酸诱发模型

VPA是一种常用的抗癫痫药物，也用于治疗双相情感障碍和神经性疼痛。临床研究表明，孕期服用VPA会增加神经管缺陷发生率、发育迟缓和认知障碍，并可诱发ASD。研究表明，产前暴露于VPA诱导的胚胎小鼠，其大脑中H3和H4组蛋白短暂高乙酰化可能与产后ASD样行为障碍相关[49]。此外，在大脑发育阶段接触VPA也可导致ASD样行为，其机制可能是通过抑制糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK3β）从而促进Wnt信号影响神经元发育过程中的轴突重塑[50]。还有研究发现，VPA可通过β-catenin-大鼠肉瘤病毒原癌基因蛋白（rat sarcoma viral oncoyene homolog，Ras）-细胞外信号调节蛋白激酶p21（extracellular signal-regulated kinase-p21，ERK-p21）通路影响神经祖细胞分化和增殖[51]。还可抑制参与GABA降解的GABA转氨酶，并增强GABA合成酶谷氨酸脱羧酶活性，因此，VPA暴露可能导致GABA水平的显著升高[52]。总之，胚胎发育早期暴露于VPA环境可能会影响大脑发育过程中神经网络的成熟，进而导致ASD样行为表型。

LIU等[53]发现，VPA诱导的ASD大鼠模型表现出ASD患者相似的肠道菌群失调。YASUE等[54]研究发现，VPA暴露可诱发狨猴缺乏社会动机并降低对其同类的兴趣，还发现该狨猴不会表现出对不公平待遇的厌恶。

2.2.2 沙利度胺模型

沙利度胺可引起多种先天性缺陷，如出生时缺失拇指、四肢发育不全、眼和耳缺陷及患有先天性心脏病等。TSUGIYAMA等[55]通过将孕大鼠产前第9和10天暴露于沙利度胺制备子代ASD大鼠模型。将该模型大鼠暴露于16 kHz纯音环境下进行听觉刺激，发现其具有听觉过敏表型。NARITA等[56]检测了暴露于沙利度胺的大鼠行为学表型，仅发现其学习能力受损，未发现其他典型的ASD样行为表型。

2.2.3 米索前列醇模型

米索前列醇是一种前列腺素类似物，通常用于防治胃溃疡。有证据表明，产前暴露于高剂量（40 μg·kg-1）米索前列醇可导致默比乌斯综合征、颅神经核受损而导致单侧或双侧面神经麻痹、肌肉或骨骼肌畸形以及ASD样行为症状。KOENIG等[57]研究发现，孕期暴露于米索前列醇40 μg·kg-1的小鼠，其子代呈现出明显的异常行为，但并未发现显著的ASD样行为和神经功能障碍。由于目前尚无令人信服的证据表明孕期暴露米索前列醇是神经发育障碍（包括ASD）的一个危险因素，因此，未来仍需进一步深入开展相关研究。

2.3 生物因素诱导

2.3.1 肠道菌群（gut microbiota，GM）模型

研究表明，GM的变化可调节胃肠生理、免疫功能甚至行为，GM中的特定细菌与ASD相关表型之间也可能存在一定相关性[58]。CORETTI等[59]研究了具有ASD相关表型的特发性BTBR T+tf/J近交系小鼠的GM变化，发现其GM显著异常、肠道通透性增加以及免疫失调。SHARON等[60]将来自ASD患者和正常人的GM移植到无菌小鼠肠道中，证实源自ASD患者的GM足以诱导明显的ASD样行为。目前研究认为，GM可通过调节神经活性代谢产物影响小鼠行为，表明肠-脑轴可能与ASD的发病和病理生理学进程密切相关。

2.3.2 丙酸（propionic acid，PPA）模型

PPA为一种短链脂肪酸，是肠道细菌代谢终产物，也是一种常见食品防腐剂。许多研究表明，PPA可引起大鼠ASD样行为和神经炎症反应。MACFABE等[61]发现，PPA处理的大鼠表现出对特定物体兴趣减少和社交行为减弱的特征，免疫组织化学分析显示，其脑组织反应性星形胶质细胞增生和小胶质细胞活化，表明其具有先天性神经炎症反应。

LOBZHANIDZE等[62]探讨PPA对大鼠社交行为、焦虑行为和杏仁核中央核超微结构的影响。结果表明，急性给予相对较低剂量的PPA（175 mg·kg-1）即可导致大鼠社交行为显著减少。上述研究结果为利用PPA建立啮齿类ASD动物模型提供了实验依据，但这种模型与人类ASD之间的相关性仍有待进一步深入验证。

2.3.3 博尔纳病病毒（Borna disease virus，BDV）模型

BDV是一种高度嗜神经性、非节段性、单股负链的RNA病毒。感染BDV的新生鼠表现为海马和小脑发育异常和学习的障碍，这与一些ASD患儿的行为障碍表现较为一致。PLETNIKOV等[63]利用BDV感染幼年大鼠建立了一种全新的ASD动物模型，该动物模型表现出感觉、运动、社交、情绪和认知等多种行为障碍。BDV作为一个独特的致畸因子，可望用于研究遗传与环境相互作用的病理生理学机制，也有助于开展临床前药物治疗测试。

3 展望

本文主要针对目前实验室常见的孤独症谱系障碍实验动物模型及其构建方法进行了系统梳理和总结，相关研究可望为深入理解ASD的病因、发病机制和诊疗提供理论依据和实验支撑。需指出，由于不同ASD患者在遗传和表型方面存在较大差异，因此，很难明确哪种实验动物模型或哪种构建方法是模拟ASD发生的最佳模型，不同模型之间只有相互借鉴、优势互补才能最大限度地发挥其研究价值。

随着发育神经生物学、系统生物学、连接组学、新型多光子在体成像技术、单细胞技术和诱导多能干细胞等学科和技术的不断完善和突破，未来神经科学家们可借助新工具和新方法产生的新信息和线索，用于指导新型实验动物模型的制备和研究，必将进一步深化对ASD致病机制的理解，为开发新型ASD诊疗手段提供重要支撑。