EPCs移植对去卵巢大鼠骨质疏松的影响

欧阳利云 唐颖 上官文峰

河南科技大学第三附属医院脊柱外科，河南 洛阳 471003

绝经后骨质疏松症(osteoporosis,OP)的主要特征为全身骨量的逐渐减少，骨组织结构紊乱,骨强度减低，骨的脆性增加，极易发生骨折。其病理机制为骨吸收代谢后，未分化的干细胞不能及时的分化为成骨细胞，导致了骨形成不足[1-3]。近年来对于OP治疗方法有众多的研究，如药物治疗、中医针灸、中药治疗等，但临床治疗效果仍有待进一步提高。干细胞移植治疗为近年来的研究热点[4-5]，即通过干细胞移植发挥对骨质疏松的治疗作用。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是一类能够循环、增殖并有着在特定情况下分化为各种细胞的功能[6-7]。本实验通过切除雌性大鼠卵巢，降低大鼠雌激素分泌，从而构建绝经后骨质疏松症大鼠模型，进而通过尾静脉移植同源异体的EPCs，评估该治疗对骨质疏松大鼠TGF-β/Smads通路的影响及治疗效果。

1 材料和方法

1.1 材料及来源

骨密度测定仪器(CHAILENGE双能X线， 法国 GK 公司);胎牛血清(货号16000-044);DMEM培养基(货号11965-092,美国Gibco BRL公司);胰蛋白酶(Amreseo公司);Trizol试剂盒(上海华舜公司);体重计(美国GE公司); BAP酶联免疫测定试剂盒、 CTX-I检测试剂盒、 TRAP5b检测试剂盒(宝生物工程有限公司，大连);TGF-β1、Smad2、Smad3、GAPDH兔抗大鼠多克隆抗体、HRP标记的山羊抗兔IgG(英国Abcam公司)；胰蛋白酶、RT-PCR试剂盒(碧云天生物技术有限公司);引物(上海生工);大鼠EPCs(武汉优尔生商贸有限公司)

1.2 方法

1.2.1实验动物与分组：60只Wistar大鼠，均为雌性、未孕，体重220～260 g，由河南科技大学动物实验室提供，生产许可证号：SCXK(豫)2014-0010，实验动物使用许可证号：SYXK(豫) 2014-0014。所有大鼠均在相同条件下进行饲养。随机均分为假手术组、模型组及EPCs组，每组20只。

1.2.2EPCs的复苏及培养：将EPCs恒温水浴箱快速复苏，待细胞完全融化后，离心弃上清，PBS洗涤细胞，以DMEM完全培养液对细胞重悬，调整EPCs浓度至2×l08/L，于37 ℃、5% CO2培养箱内培养，隔2 d换液1次，定期换液及传代，培养1～14 d，观察到细胞的增殖良好。

1.2.3模型的建立：吸入乙醚麻醉后固定大鼠，消毒皮肤后，以腰椎后正中位行皮肤切开，分离腰椎两侧肌肉，暴露并打开腹膜，显露出双侧卵巢。模型组及EPCs组将双侧卵巢完全切除，假手术组同部位、同法切皮，仅切除卵巢周边少许组织，但不行卵巢切除，手术完成后腹腔撒入青霉素粉末，依次逐层缝合组织和皮肤。 1周时进行尾静脉注射治疗，假手术组注射L-DMEM培养液0.5 mL、模型组注射L-DMEM培养液0.5 mL、EPCs组注射EPCs悬液0.5 mL，2×l08个/L，连续注射7 d。

1.2.4测定各组大鼠的体质量：造模后1、4、8、11、13周测定并记录每组大鼠的体质量。过程如下，将体重计置于水平桌面，置“0”后体重计上测定小桶质量并记录，后将各组每只大鼠分别置于小桶中测量并记录，此读数减去小桶质量读数为大鼠体质量，重复3次测定，取均值。

1.2.5ELISA法检测血清 25(OH)D、CTX-I、BAP、TRAP5b的表达变化：13周时，随机取每组各5只大鼠，仰卧位固定后，经大鼠尾静脉通过注射器采血，将血液注入离心管后，离心半径140 mm，离心3 000 r/min，离心15 min。吸取上清液，通过ELISA法行血清25(OH)D、BAP、CTX-I、TRAP5b含量测定，按照试剂盒说明书进行，记录检测结果。

1.2.6骨密度及骨钙含量测定:于造模后第13周，从每组大鼠中随机选5只，通过颈部脱臼法处死。固定后，于无菌条件下取出大鼠的右侧股骨，对大鼠股骨中点进行标记，分别行大鼠右侧股骨中点、远端及近端骨密度检测。经骨密度仪测定并记录结果。取左侧股骨在支架上固定，用手术刀剔除股骨上附着的组织，剔除干净后，用原子吸收法对股骨钙含量进行测定并记录。

1.2.7股骨生物力学检测及HE染色：于造模后第13周，从每组大鼠中随机选5只，通过颈部脱臼法处死。将大鼠在支架上固定，通过手术刀取出大鼠的股骨，用手术刀剔除股骨上附着的组织，然后对股骨的生物力学进行测试，通过三点弯曲实验进行检测，将每组大鼠处理后的股骨放在试验机上测试，加载速度为2.0 mm/min，跨距设置为17 mm，根据结果描绘应力-应变曲线。然后用10%的甲醛行股骨固定，制作股骨组织切片；通过梯度乙醇脱水后，经过石蜡包埋，制作4～ 5 μm厚的连续切片，脱蜡，行HE染色，在光学显微镜下观察。

1.2.8TGF-β1、Smad2、Smad3基因表达检测：将各组剩余大鼠以颈部脱臼法处死，取大鼠椎体组织90 mg，液氮至冻后研磨，按照Trizol 试剂说明书步骤提取椎体组织总RNA，通过紫外分光光度计测定RNA的总含量，通过RT-PCR两步法试剂盒将mRNA反转录为cDNA。TGF-β1上游引物：5′-GTCAGACATTCGGGAGCAG-3′，下游引物：5′-AGACAGAAGTTGGCATGGTAGC-3′，产物长度为558 bp；Smad2上游引物：5′-GACTATACCCTCAATACCAT-3′，下游引物：5′-CGAAAGCCGTACTCCATTCCAG-3′，产物长度为610 bp; Smad3上游引物：5′-ACAATAACTTGGACCTACAGCC-3′，下游引物：5′-GTCAACTGGTAGACAGCCTCA-3′，产物长度为454 bp;内参GAPDH上游引物：5′- GAGGACCAGGTTGTCTCC TG-3′，下游引物：5′- GGATGGAATTGTGAGGGAGA -3′，产物长度为300 bp。PCR反应条件如下:于94 ℃条件下变性，1 min, 55 ℃温度下退火，退火时长为30 s，于72 ℃延伸，延伸1 min，共45个循环。

1.2.9TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表达检测：将RT-PCR提取后的剩余物以1 500 r/min 离心30 min，取上清为粗体蛋白，通过BCA试剂盒行蛋白浓度测定。每组取蛋白40 μg，行10% SDS-PAGE凝胶电泳(条件为65 V，30 min；95 V，90 min)，蛋白电泳分离后通过半干法将蛋白电转于硝酸纤维素膜。5%脱脂牛奶室温封闭2 h (或4 ℃过夜)；然后加入相应一抗TGF-β1、Smad2、Smad3鼠单抗(1∶100)、GAPDH鼠单抗(1∶800)4 ℃孵育过夜。PBS将未结合的抗体洗去，加入二抗羊抗兔IgG(1∶1 000)孵育1 h，将未结合蛋白洗去，经ECL发光显色后，X线照相后，通过Quantityone 软件行灰度值统计分析。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 EPCs形态观察

显微镜下观察，培养1周内可见贴壁的EPCs逐渐增多，且体积增大，细胞形态呈纺缍形、多边形或类圆形，见图1 A；继续培养1 周可见贴壁细胞形态呈“铺路石”样的外观，细胞数显著增多，表明细胞增殖良好，见图1B。

图1 EPCs形态观察 (×100) A:传代1周内的EPCs(×100);B:培养2 周时的EPCs(×100)。Fig.1 Morphological observation of EPCs A: EPCs within 1 week of passage (×100); B: EPCs at 2 weeks of culture (×100).

2.2 各组大鼠的体质量

大鼠的体质量测定结果表明三组大鼠的体重均逐渐增加，符合动物生长规律。于造模后8周起，模型组体质量较假手术组升高(P<0.05)，见图2。

图2 各组大鼠的体质量比较Fig.2 Comparison of body mass in each group of rats

2.3 骨密度及骨钙含量测定

在造模后第13周，模型组股骨骨密度及骨钙含量较假手术组明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；EPCs组股骨骨密度和骨钙含量较模型组显著升高(P<0.05)，见表 1。表明EPCs移植治疗能够有效提高去卵巢骨质疏松大鼠骨密度和骨钙含量，发挥治疗作用。

2.4 各组大鼠25(OH)D、CTX-I、BAP、TRAP5b的表达变化

在造模后第13周，与假手术组比较，模型组血清25(OH)D、BAP水平降低，CTX-I、TRAP5b的水平升高(P<0.05)。与模型组比较，EPCs组血清25(OH)D、BAP水平升高，CTX-I、TRAP5b水平降低(P<0.05)。表明EPCs移植治疗能够有效地提高去卵巢OP大鼠血清25(OH)D、BAP水平、降低 CTX-I、TRAP5b水平，见表2。

表1 大鼠股骨BMD值和骨钙含量测定Table 1 BMD and bone calcium content in rat femur

注：与假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05。

表2 大鼠血清中25(OH)D、CTX-I、BAP、TRAP5b的表达Table 2 Expression of 25(OH)D, CTX-I, BAP and TRAP5b in rat serum

注：与假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05。

图3 大鼠股骨组织病理学形态变化(×100)A：模型组;B：EPCs组;C：假手术组。Fig.3 Pathological changes in rat femoral tissue (×100) A：model group；B：EPCs group；C：sham operation group.

2.5 生物力学性能的变化

在造模后第13周，通过三点弯曲实验检测生物力学性能，显示模型组极限载荷、极限应力和弹性模量明显低于假手术组(P<0.05),EPCs组的极限载荷和弹性模量比模型组有显著增高(P<0.05),见表3。

2.6 HE染色

图3所示13周时，模型组骨小梁有断裂，变稀疏，排列紊乱，间隙增大;EPCs组骨小梁窄较之减轻，部分骨小梁较粗，骨小梁排列较之规则、间隙增小于模型组;假手术组骨组织结构完整，以上病理变化进一步减轻。

表3 大鼠股骨生物力学检测Table 3 Biomechanical testing of rat femur

注：与假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05。

2.7 TGF-β/Smad信号通路基因表达影响

图4所示，TGF-β/Smads信号通路检测显示EPCs组TGF-β1及Smad2、Smad3基因表达上调，与模型组相比显著升高，与假手术组相近(P<0.05)。表明EPCs移植可能通过调高TGF-β/Smads通路发挥作用。

图4 各组椎体TGF-β/Smad基因表达 A:TGF-β/Smad 基因表达条带图;B:TGF-β/Smad 基因表达水平。Fig.4 TGF-β/Smad gene expression in vertebral body of each group A: TGF-β/Smad gene expression band map; B: TGF-β/Smad gene expression.

2.8 TGF-β/Smad信号通路蛋白表达影响

图5所示， TGF-β/Smads信号通路检测显示EPCs组TGF-β1及Smad2、Smad3信号通路蛋白的表达，与模型组相比显著升高，与假手术组相近(P<0.05)。表明EPCs移植可能通过调高TGF-β/Smads通路发挥作用。

图5 各组椎体TGF-β/Smad蛋白表达 A:TGF-β/Smad 蛋白表达条带图;B:TGF-β/Smad 蛋白表达水平。Fig.5 TGF-β/Smad protein expression in vertebral body of each group A: TGF-β/Smad protein expression band map; B: TGF-β/Smad Protein Expression.

3 讨论

骨质疏松为老年女性常见病之一，其根本原因为女性更年期后，机体雌激素水平逐渐降低[8]，骨吸收与骨形成的平衡受到影响，导致骨骼密度和骨钙含量降低，最终骨强度变小，骨脆性增加，极易发生骨折[9]。大鼠卵巢摘除去势手术建立的骨质疏松动物模型，模拟了这一疾病的生理条件和进程，为目前国内外筛选骨质疏松药物和治疗方案的首选动物模型[10]。EPCs是一群具有增生能力和能够分化为血管内皮细胞的潜能干细胞， 能够促进损伤血管的再生，在机体损伤修复过程中扮演着不可缺少的角色，在特定条件下可以分化为多种细胞，因此成为近些年来干细胞研究的热点，并且取得了令人瞩目的成绩[6,11]。最近相关研究[12]表明EPCs还具有分化为造血细胞和成骨细胞的能力。同时临床研究[13]表明老年人骨髓内皮祖细胞的数量与骨密度成显著正相关,表明内皮祖细胞对骨组织新陈代谢可能有正调控作用，能够有效提高老年人的骨量，减轻骨质疏松。由此可以推测若通过静脉移植EPCs、提高体内成骨细胞的数量，可能对骨质疏松发挥治疗作用。

本实验通过大鼠去势建立骨质疏松模型后，经EPCs尾静脉移植进行干预。研究结果显示移植后13周，与模型组相比，EPCs组大鼠血清25(OH)D、BAP水平升高，25(OH)D、BAP为成骨细胞活性增加的重要标志，表明EPCs移植后促进了骨质生成;CTX-I、TRAP5b的表达出现降低，CTX-I、TRAP5b为骨吸收主要标志物，表明EPCs移植后骨吸收减少。本研究显示模型组骨密度和骨钙含量较假手术组明显降低，表明大鼠骨质疏松造模成功。EPCs移植组骨密度和骨钙含量较模型组明显升高，说明EPCs移植对去势骨质疏松大鼠有治疗作用。生物力学检测表明，模型组极限载荷、极限应力和弹性模量明显低于假手术组，EPCs组的极限载荷和弹性模量比模型组有显著增高。进一步在基因蛋白水平对大鼠椎骨TGF-β/Smads信号通路的检测显示，EPCs组TGF-β1及Smad2/3的表达，与模型组相比显著升高，与假手术组相近，表明EPCs大鼠尾静脉移植能够对卵巢骨质疏松大鼠起到有效的治疗作用。

综上，EPCs移植可能通过调控TGF-β/Smads通路发挥治疗去卵巢大鼠骨质疏松症的作用。