基于16S rRNA高通量测序技术分析I型骨质疏松大鼠肠道菌群结构变化

马思聪 郝永强 富灵杰

上海市骨科内植物重点实验室，上海交通大学医学院附属第九人民医院骨科，上海 200011

近年来，从骨免疫学及骨微生物学的新概念证实了肠道菌群与骨代谢之间的紧密联系，干预与调节肠道菌群有望成为预防和治疗绝经后骨质疏松症的新策略[1-6]。目前，骨质疏松症的肠道菌群结构改变的时间变化规律尚不清楚。本研究拟利用去势大鼠构建I型骨质疏松症动物模型，利用16S rRNA高通量测序技术分析比较去势前后的肠道菌群的结构变化并提供较为详细的实验数据，为明确骨质疏松症和肠道菌群的发病联系提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

采用12周龄雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠，共24只，体重228～265 g。由上海交通大学医学院附属第九人民医院动物实验中心提供(SCXK2012-0002)。

1.2 I型骨质疏松大鼠动物模型建立及粪便肠道菌群收集

SD大鼠适应性饲养1周后，随机分为4组，每组各6只。去势前组的6只大鼠收集骨骼和肠菌样本。去势后4周组、8周组、12周组各6只大鼠采用去势法建立I型骨质疏松大鼠模型。具体方法是[7]：采用戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉，麻醉生效后，大鼠放置于俯卧位并固定四肢，腰背部消毒铺巾。采用胸腰段后背直切口，从双侧肋脊角进入腹腔，依靠局部的脂肪组织辨认卵巢，顺利结扎并切除卵巢，同法处理另一侧卵巢组织。最后逐层缝合，关闭切口。术后于腹腔内注射镇痛药和抗生素，大鼠每2只置于单笼饲养，自由进食水，12 h光照周期。

采用DXA法测量去势前组及去势12周组的大鼠骨密度BMD，鉴定模型是否构建成功。收集去势前和去势后4周、8周、12周组的肠菌标本：采用直接收集法采集大鼠粪便，收集过程中严格采用无菌操作。每只大鼠收集0.25～0.45 g，储存于-80 ℃冰箱。

1.3 16S rRNA高通量肠菌测序

1.3.1基因组DNA抽提及PCR扩增：采用DNA提取试剂盒E.Z.N.A.® Soil DNA Kit (D5625-01)，按照操作说明对每个大鼠粪菌样本进行DNA提取。首先，用1%琼脂糖凝胶电泳对抽提的基因组DNA检测其完整性，并检验浓度和纯度。其次，指定V3及V4可变区域并合成带有barcode的特异引物。扩增体系具体为：5×FastPfu Buffer 4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、Forward Primer (5 μmol/L) 0.8 μL、Reverse Primer (5 μmol/L) 0.8 μL、FastPfu Polymerase 0.4 μL、Template DNA 10 ng、补充dd H2O至20 μL。扩增条件为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，循环27次；72 ℃ 10 min。每个样本重复3次，将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN，美国)对PCR产物进行切胶并回收，Tris-HCl洗脱。利用2%琼脂糖进行电泳检测，参照电泳初步定量结果，利用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统(Promega，美国)对PCR产物进行检测，按照每一个样本的测序量要求进行对应比例的混合[8-9]。

1.3.2文库构建与测序：区分样本后采用Illumina平台构建文库并进行16S rRNA肠菌测序。

1.4 统计学处理

2 结果

与去势前BMD比较，雌性SD大鼠去势后12周的全身骨密度显著下降(P<0.05)(图1)，表明I型骨质疏松大鼠模型构建成功。

图1 去势大鼠骨质疏松模型的建立去势前与去势后12周的大鼠全身骨密度比较(P<0.05)。Fig.1 The establishment of ovariectomized rat model: comparison of total BMD between pre- and 12 weeks post-ovariectomy (P<0.05)

2.1 门(phylum)级别的物种差异变化

为了比较去势前和去势后不同时间点的大鼠的肠道菌群的物种差异，我们首先对比了24个样本(4组，n=6)中的肠道菌群在肠菌的门(phylum)级别的物种组成(图2)。结果显示，厚壁菌门与拟杆菌门是肠道菌群的主要构成肠菌，无论在去势前或去势后，二者含量之和均超过肠道菌群总量的90%。其中，厚壁菌门在去势后出现了下降的趋势，一直持续到术后8周。然而，厚壁菌门的含量随后出现了明显的增加，并且这种增加和去势前比较差异有统计学意义(P<0.05)。与此相反，拟杆菌门的含量在去势后逐渐增加，一直持续到术后8周，随后其含量显著下降。变形菌门的含量没有出现显著性的变化(P>0.05)。

图2 门(phylum)级别的物种差异变化Fig.2 Abundance difference in phylum level of gut microbiota

2.2 纲(class)级别的物种差异变化

纲是隶属于门的分类级别，通过比较纲级别的物种差异能够进一步细化肠菌变化特征(图3)。梭菌纲(厚壁菌门)和拟杆菌纲(拟杆菌门)是含量最大的肠道菌群。梭菌纲的含量变化趋势和厚壁菌门基本一致，在去势后下降并持续到术后8周；同样，在术后12周其含量显著增高。类似的，拟杆菌纲的含量变化趋势和拟杆菌门趋于一致。芽孢杆菌纲(厚壁菌门)在去势术后8周显著增多。

2.3 目(order)级别的物种差异变化

在目级别的肠道菌群构成上，梭菌目(梭菌纲)和拟杆菌目(拟杆菌纲)则是主要的肠道菌群(图4)。梭菌目的变化规律和梭菌纲、厚壁菌门在各自级别的肠道菌群构成的变化规律趋于一致。而拟杆菌目的变化规律则和拟杆菌纲、拟杆菌门在各自级别的变化趋势相似。另外，乳杆菌目在去势12周时其含量显著增加。

2.4 科(family)级别的物种差异变化

图3 纲(class)级别的物种差异变化Fig.3 Abundance difference in class level of gut microbiota

图4 目(order)级别的物种差异变化Fig.4 Abundance difference in order level of gut microbiota

图5 科(family)级别的物种差异变化Fig.5 Abundance difference in family level of gut microbiota

随着肠菌分类级别的细化，去势大鼠的科级别的肠道菌群出现了较为复杂的变化(图5)。首先，毛螺旋菌科(梭菌目)、s24-7(拟杆菌目)和瘤胃菌球科(梭菌目)是肠道菌群的主要构成肠菌。其次，毛螺旋菌科(去势前：53.1%)在去势后其含量显著降低(去势后4周：22.0%)，一直持续到术后8周(24.4%)，随后其含量逐渐增高(去势后12周：48.7%)。S24-7去势后含量逐渐增加，而8周后其含量降低。瘤胃菌球科的含量在去势后逐渐增加(去势后12周：18.0%)。普雷沃氏菌科在去势后12周显著降低(P<0.05)。

2.5 属(genus)和种(species)级别的物种差异变化

16S rRNA 测序法的优势在于测序结合保守区和可变区，能够将基因序列准确地归类到属级别。加以更加严格的对比条件，可以分析出样本间的种级别差异(表1)。与术前比较，普雷沃氏菌属(普雷沃氏菌科)、Odoribacter 含量在术后12周明显降低(P<0.05)。而螺杆菌属(螺杆菌科-弯曲菌目-ε变形菌纲-变形菌门)与Alistipes在术后12周含量增多(P<0.05)。在种级别的分类中，白色瘤胃球菌在术后12周显著增多(P<0.05)。相反，单形拟杆菌含量显著降低(P<0.05)。见表2。

项目术前/(%)术后12周/(%)P值普雷沃氏菌属6.1670±2.04300.7633±0.07470.045 螺杆菌属0.0416±0.01300.3933±0.11460.027 YS20.0516±0.01010.0200±0.00730.031 Odoribacter0.0600±0.01090.0233±0.00550.019 Alistipes0.0216±0.00470.1300±0.03530.027

项目术前/(%)术后12周/(%)P值白色瘤胃球菌0.2139±0.04930.4368±0.06160.006 单形拟杆菌 0.0165±0.00850.0083±0.00210.005

3 讨论

胃肠道内富含人体内种类最多、密度最大的微生物群落，按照界、门、纲、目、科、属、种分类[10]。阐明肠道菌群及其代谢产物在绝经后骨质疏松症发病过程中的变化规律和结构特征，是深入了解肠道菌群调节机制的重要前提。临床研究发现，原发性骨质疏松症患者的肠道菌群OTUs数量与Alpha多样性高于对照组[8-9]。然而，也有研究显示低骨量人群的OTUs和肠菌种类的数量低于对照组[11]。上述研究结果不一致的原因可能和其临床试验的入排标准、病例数量、性别比例等差异有关[12]。目前，肠道菌群在绝经后骨质疏松症发病过程中的时间变化规律尚未完全阐明。

本研究通过去势法构建I型骨质疏松动物模型，其优点是该模型是经典的I型骨质疏松症的实验研究使用的动物模型，其试验动物间的个体差异较小。本研究发现，雌性大鼠去势后，厚壁菌门的梭菌纲的梭菌目的毛螺旋菌科的螺杆菌属，以及厚壁菌门的梭菌纲的梭菌目的瘤胃球菌科的白色瘤胃球菌属，其含量在去势后显著增多，而拟杆菌门的拟杆菌纲的拟杆菌目的普雷沃菌科的普雷沃菌属含量显著下降。

16S rRNA测序技术是目前微生物系统实验研究中鉴定肠道菌群的常用方法。我们发现在去势后12周时，白色瘤胃球菌含量显著增多，而单形拟杆菌的含量显著降低，其差异具有统计学意义。虽然本研究不能证实骨质疏松症的发生和这些肠菌含量变化之间的因果关系，未来应进一步利用肠菌移植等方法研究这些肠菌对骨质疏松症发生的作用与影响，阐明特异肠菌对机体骨量变化的影响。在种(species)级别的肠道菌群测序上，宏基因组学的优势在于其测序程度更深以及可测序列更加完整，但价格昂贵。因此，未来需进一步结合宏基因组学测序技术进一步验证肠道菌群与骨质疏松症的内在关系。

综上所述，I型骨质疏松的肠道菌群数量和结构组成在门、纲、目等级别上发生了显著性改变，为研究肠道菌群和骨质疏松症的关系提供理论依据。