PPARγ激动剂通过Nrf2介导的抗氧化通路改善体内外高脂诱导的氧化应激和炎症反应*

李晓芸 倪茜茜 华 静

上海交通大学医学院附属仁济医院消化内科 上海市消化疾病研究所(200001)

背景：氧化应激在非酒精性脂肪性肝病的发生、发展中起重要作用。近年研究表明过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)激动剂具有抗炎、抗氧化活性。目的：探讨PPARγ激动剂罗格列酮和GW1929对体内外高脂诱导的肝细胞氧化应激损伤的保护作用及其可能机制。方法：C57BL/6J小鼠喂饲高脂饮食并予罗格列酮灌胃干预(30 mg/kg,每日一次，连续4周)；分离小鼠原代肝细胞，以GW1929预处理后予混合游离脂肪酸(FFA)孵育。以HE染色和油红染色评估肝脏组织病理学改变和脂质沉积；测定血清丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性；DCFH-DA荧光探针检测肝细胞内活性氧(ROS)含量；Real-time PCR和蛋白质印迹法检测氧化应激和炎症相关基因表达。结果：高脂饮食小鼠肝脏显著脂肪变性，肝内炎症相关基因表达上调，血清MDA含量升高，SOD活性和GSH含量降低。罗格列酮干预可显著减轻高脂饮食诱导的肝脏脂质沉积，下调炎症相关基因表达，改善血清氧化应激相关指标。FFA孵育的原代肝细胞内ROS大量生成，GW1929预处理可显著减少FFA诱导的ROS生成和炎症相关基因表达，并上调抗氧化因子核因子E2相关因子2(Nrf2)及其下游靶基因血红素氧合酶-1(HO-1)表达。结论：体内外高脂环境均可诱导肝细胞脂肪变性，发生显著的氧化应激和炎症反应。PPARγ激动剂可通过减少ROS产生、激活Nrf2/HO-1抗氧化通路改善高脂诱导的氧化应激损伤和炎症反应。

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是一种除外乙醇和其他明确致病因素、以肝细胞异常脂肪蓄积为主要特征的临床病理综合征，其发生与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关[1]。目前被广泛认可的“二次打击”学说认为，肝脏脂质沉积触发一系列氧化应激和炎症反应是促进NAFLD发生、发展的始动因素[2]。因此，抑制氧化应激和炎症反应已成为治疗和改善NAFLD的重要途径。近年研究发现，过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ)在改善胰岛素抵抗、平衡脂质代谢、调节免疫和炎症反应方面发挥重要作用。PPARγ激动剂可改善NAFLD小鼠的胰岛素抵抗和肝脏损伤，但其对抗高脂诱导的氧化应激损伤的作用机制尚不清楚。本研究分别应用PPARγ激动剂罗格列酮(rosiglitazone)和GW1929，对高脂诱导的NAFLD模型小鼠和脂肪变性肝细胞模型进行干预，旨在探讨PPARγ激动剂对体内外高脂诱导的肝细胞氧化应激损伤的保护作用，并探讨其可能作用机制，为NAFLD的临床治疗提供理论依据。

材料与方法

一、实验动物和主要试剂

健康雄性SPF级8周龄C57BL/6J小鼠由上海交通大学医学院附属仁济医院实验动物中心提供；高脂饲料(40%脂肪，40%碳水化合物，20%蛋白质；Research Diets)。棕榈酸(palmitic acid, PA)、油酸(oleic acid, OA)、罗格列酮、GW1929、Ⅰ型和Ⅳ型胶原酶、台盼蓝染料(Sigma-Aldrich, Merck KGaA)；D-Hanks液、DMEM培养基、胎牛血清(Gibco, Thermo Fisher Scientific)；鼠尾胶原蛋白Ⅰ型(上海创赛科技有限公司)；油红O染色液(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；丙二醛(malon-dialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、还原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；DCFH-DA活性氧(reactive oxygen species, ROS)荧光探针(上海碧云天生物技术有限公司)；RNA抽提试剂、逆转录试剂盒、real-time PCR试剂盒(Takara Bio Inc.)；PCR引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]；各兔抗鼠单克隆抗体(Abcam plc.; Cell Signaling Technology, Inc.)；ECL化学发光试剂盒(Pierce, Thermo Fisher Scientific)。

二、方法

1. 实验动物分组和造模[3]：30 只C57BL/6J小鼠随机分为正常饮食组(normal control, NC组)、高脂饮食组(high-fat diet, HF组)和罗格列酮干预组(high-fat diet + rosiglitazone, HF+RSG组)，每组各10只。NC组予普通饮食 16周；HF组予高脂饮食 16 周；HF+RSG组予高脂饮食12周后，在高脂饮食的同时予罗格列酮灌胃4周(30 mg/kg，每日一次)。造模结束后颈椎脱臼处死小鼠，取肝脏组织和眼球血用于后续实验。

2. 肝脏组织病理学检查和油红染色：肝脏组织标本4%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片、HE染色，光学显微镜下观察肝脏组织病理学表现。另使用最佳切削温度包埋剂进行包埋，制备冰冻组织切片，油红O染色，光学显微镜下观察脂质沉积情况。

3. 血清氧化应激相关指标检测：眼球血标本4 ℃、3 000 r/min离心15 min，取血清备用。参照试剂盒说明书，分别采用TBA比色法、羟胺法和微板法检测MDA含量、SOD活性和GSH含量。

4. 小鼠原代肝细胞分离、培养：8周龄正常饮食C57BL/6J小鼠以4%水合氯醛麻醉后打开胸腹腔，24 G穿刺针穿刺插管下腔静脉，灌注D-Hanks液，至肝脏呈土黄色后继以灌注含0.025%Ⅰ型胶原酶和 0.05% Ⅳ型胶原酶的DMEM培养基，至肝组织变软后取下、剪碎，置于含胶原酶溶液中37 ℃水浴消化，100 μm无菌筛网过滤，获得细胞悬液，离心获得肝细胞。台盼蓝染色检测细胞活力>85%，调整细胞浓度至2×106/mL，接种于铺有鼠尾胶原蛋白Ⅰ型的培养皿中，以含10%胎牛血清的培养基于37 ℃、5% CO2恒温培养箱内静置培养6 h，洗去未贴壁细胞。

5. 原代肝细胞的干预处理：按PA与OA 1∶2(PA: 0.33 mmol/L, OA: 0.66 mmol/L)的比例配制终浓度为1 mmol/L的混合游离脂肪酸(free fatty acid, FFA)[4]。原代肝细胞培养6 h后换液，设立正常对照组(NC组)、脂肪酸孵育组(FFA组)和预先以GW1929(20 μmol/L)处理3 h后再加入含FFA培养基的干预处理组(GW1929+FFA组)，于37 ℃、5% CO2恒温培养箱内培养6 h或24 h，洗去培养基，收集细胞待测。

6. 肝细胞内ROS含量检测：各组肝细胞孵育24 h后，加入DCFH-DA荧光探针(10 μmol/L)，避光孵育30 min，PBS洗涤细胞3次，荧光显微镜下观察并拍照。收集各组细胞，200 μL PBS重悬，接种于96孔板，以荧光酶标仪检测激发波长485 nm、发射波长528 nm处荧光强度。

7. 氧化应激和炎症相关基因表达检测：取少量冻存肝组织，研磨后提取总RNA；同时收集各组孵育6 h后的肝细胞提取总RNA。将RNA逆转录合成cDNA，以之为模板行real-time PCR扩增，检测氧化应激和炎症相关基因表达，实验操作按试剂盒说明书进行。目的基因引物序列见表1。反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，40个循环。2-△△Ct法计算目的基因mRNA相对表达量。

表1 Real-time PCR引物序列

8. 蛋白质印迹法：收集各组孵育24 h的肝细胞，以细胞裂解液抽提细胞总蛋白。取蛋白样品行 SDS-PAGE电泳，湿法电转至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，分别加入兔抗鼠Keap1抗体(1∶1 000)、Nrf2抗体(1∶1 000)、HO-1抗体(1∶1 000)、GAPDH 抗体(1∶10 000)，4 ℃孵育过夜；洗膜，加入HRP耦联的羊抗兔二抗(1∶10 000)，室温孵育l h；洗膜，ECL显色，暗盒X线曝光，常规显影、定影，应用ImageJ软件定量分析蛋白条带灰度值，计算目的蛋白相对表达量。

三、统计学分析

结 果

一、PPARγ激动剂对高脂饮食小鼠肝脏脂肪变性和炎症反应的影响

HF组小鼠经高脂饮食喂饲16周后，肝脏组织可见大量空泡样脂肪变性，油红染色显示大量脂质沉积；经罗格列酮干预4周的HF+RSG组小鼠肝脏组织脂肪变性明显减轻，油红染色显示中等量脂质沉积(图1A)。高脂饮食可上调肝脏组织炎症相关基因IL-6、TNF-α、IL-1β mRNA表达(P<0.01,P<0.01,P<0.01)，罗格列酮干预则可下调上述基因mRNA表达(P<0.05,P<0.05,P<0.01；图1B)。

二、PPARγ激动剂对高脂饮食小鼠血清氧化应激相关指标的影响

与NC组小鼠相比，HF组小鼠血清MDA含量明显升高，SOD活性和GSH含量降低，差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.05,P<0.01)；罗格列酮干预能明显改善高脂饮食诱导的氧化应激，与HF组相比，HF+RSG组MDA含量降低，SOD活性和GSH含量升高，差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01,P<0.01；图2)。

三、PPARγ激动剂对脂肪酸诱导的肝细胞内ROS生成的影响

DCFH-DA ROS荧光探针检测显示，FFA可诱导肝细胞内ROS大量生成，FFA组与NC组相比差异有统计学意义(P<0.01)；GW1929预处理可显著减少FFA诱导的ROS生成，GW1929+FFA组与FFA组相比差异有统计学意义(P<0.01；图3)。

四、PPARγ激动剂对脂肪酸诱导的肝细胞氧化应激和炎症相关基因表达的影响

Real-time PCR检测显示，与NC组相比，FFA组肝细胞Keap1、IL-6、TNF-α、IL-1β mRNA表达明显升高，Nrf2、HO-1 mRNA表达明显降低，差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.01)；GW1929预处理可逆转FFA诱导的肝细胞内氧化应激和炎症反应，与FFA组相比，GW1929+FFA组Nrf2、HO-1 mRNA表达上调，Keap1和各炎症相关基因mRNA表达下调，差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.05；图4)。

五、PPARγ激动剂对脂肪变性肝细胞Nrf2/HO-1信号通路的影响

蛋白质印迹法检测显示，与NC组相比，FFA组肝细胞Keap1蛋白表达明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，Nrf2、HO-1蛋白表达略有降低，差异无统计学意义(P>0.05,P>0.05)；GW1929预处理可活化Nrf2/HO-1抗氧化信号通路，与FFA组相比，GW1929+FFA组Keap1蛋白表达降低，Nrf2、HO-1蛋白表达明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.05,P<0.05；图5)。

讨 论

NAFLD的发病机制尚未完全阐明，目前最广为接受的是“二次打击”学说[2]。该学说中，“初次打击”是指以胰岛素抵抗为核心的肝脏糖脂代谢紊乱所致的肝内脂肪异常蓄积，“二次打击”则是在肝脏脂肪变性的基础上进一步产生的各种炎性因子相互作用，线粒体氧化应激功能障碍，进而导致肝细胞损伤、炎症和纤维化。氧化应激在NAFLD的致病和进展中起关键作用。机体内ROS产生与抗氧化防御能力失衡时，便会产生氧化应激，导致细胞凋亡和损伤。肝细胞脂质过载时，线粒体β-氧化活性增加，导致ROS生成增多，ROS堆积可直接造成肝细胞损伤，也可通过调控细胞内信号转导通路引起脂质过氧化和慢性炎症。本实验结果显示，在体内高脂环境下，NAFLD模型小鼠血清氧化损伤产物MDA含量升高，抗氧化指标SOD活性和GSH含量降低，提示体内发生明显的氧化应激反应。Gómez-Lechón等[4]的研究表明，以1 mmol/L浓度的混合FFA(PA∶OA=1∶2)孵育肝细胞24 h是建立体外肝细胞脂肪变性模型的最适条件，适用于探讨单纯脂肪蓄积对肝脏的影响。因此，本研究以同样配比和浓度的混合FFA孵育小鼠原代肝细胞，成功建立脂肪变性肝细胞模型。脂肪变性肝细胞处于氧化应激晚期，细胞代谢失代偿，ROS大量生成，促使胞质中的抗氧化因子Nrf2与Keap1解离，Keap1表达显著升高，Nrf2及其下游靶基因HO-1则因早期参与抗氧化而大量耗损，表达显著降低，提示体外高脂环境同样可诱导肝细胞发生明显的氧化应激反应。

**与NC组比较，P<0.01；两组间比较，a P<0.05，b P<0.01

与NC组比较，*P<0.05，**P<0.01；两组间比较，a P<0.05，b P<0.01

绿色荧光代表肝细胞内ROS

**与NC组比较，P<0.01；两组间比较，a P<0.05，b P<0.01

*与NC组比较，P<0.05；a两组间比较，P<0.05

PPARγ属于核激素受体超家族，是一种配体应答型转录因子，通过配体激活实现核转位而调节靶基因表达。除参与脂质代谢外，PPARγ在胰岛素抵抗、免疫调节、炎症反应、纤维化等生理和病理过程中也发挥重要作用[5]。激活体内的PPARγ可增加脂肪组织对胰岛素的敏感性，促进脂肪细胞摄取FFA，减少FFA向肝脏流动，从而改善脂肪肝[6]。Soliman等[7]报道，PPARγ激动剂吡格列酮可改善高血压模型大鼠体内的氧化应激状态。另有研究[8]发现，PPARγ激动剂罗格列酮可升高妊娠期糖尿病模型小鼠的血清SOD活性和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)含量，同时降低促炎细胞因子TNF-α水平，改善模型小鼠体内的氧化应激状态和炎症水平。关于PPARγ在NAFLD中的抗氧化活性及其具体作用机制，目前尚未完全阐明。本研究以噻唑烷二酮类PPARγ激动剂罗格列酮灌胃干预高脂饮食诱导的NAFLD模型小鼠，结果显示罗格列酮可显著减轻小鼠的肝脏脂质沉积、改善其体内氧化应激和炎症水平(血清MDA含量和肝脏组织IL-6、TNF-α、IL-1β mRNA表达降低，血清SOD活性、GSH含量升高)。为进一步探究PPARγ激动剂改善NAFLD氧化应激损伤的可能作用机制，本研究进一步在体外以混合FFA诱导小鼠原代肝细胞建立脂肪变性肝细胞模型，并予PPARγ激动剂GW1929干预。GW1929是一种新型的具有酪氨酸残基的非噻唑烷二酮类PPARγ激动剂，与PPARγ具有高度亲和力。体外实验结果显示，经FFA诱导的原代肝细胞内ROS大量生成，氧化应激水平明显升高，如予GW1929预处理，肝细胞内ROS水平与未予GW1929预处理的肝细胞相比显著降低，同时Keap1表达降低，抗氧化因子Nrf2、HO-1表达升高，各炎症相关基因表达降低，提示PPARγ激动剂可明显提高脂肪变性肝细胞的抗氧化应激和抗炎能力。

Nrf2是体内重要的参与调控抗氧化应激反应的转录因子。生理状态下，Keap1以泛素化底物结合蛋白的形式与Nrf2在细胞质中结合，Nrf2被泛素化修饰并快速降解，从而维持体内氧化还原平衡状态；在氧化应激环境中，ROS的产生导致Nrf2与Keap1解离，活化的Nrf2转移至细胞核，与靶基因启动子区的抗氧化反应元件(antioxidant response element, ARE)结合，从而上调HO-1、NAD(P)H∶醌氧化还原酶1[NAD(P)H∶quinone oxidoreductase 1, NQO1]等细胞保护酶和抗氧化基因表达，以对抗氧化应激损伤[9]。在非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)模型小鼠中，激活Nrf2可通过抑制氧化应激改善炎症和肝纤维化[10]。本研究体外实验也发现，经GW1929预处理的脂肪变性肝细胞，Keap1 mRNA和蛋白表达降低，抗氧化因子Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白表达升高，提示PPARγ激动剂激活了Nrf2/HO-1抗氧化通路，从而减轻肝细胞氧化应激损伤，并可能通过此信号通路降低肝细胞炎症水平。

综上所述，体内外高脂环境均可诱导肝细胞脂肪变性，发生显著的氧化应激和炎症反应；PPARγ激动剂不仅能改善肝脏脂质沉积，而且可通过减少ROS生成、激活Nrf2/HO-1抗氧化通路改善高脂诱导的氧化应激损伤和炎症反应，从而发挥抗炎和肝细胞保护作用。上述发现为PPARγ激动剂用于NAFLD的临床治疗提供了一定的理论依据。