伯氏疏螺旋体套式PCR检测方法建立及应用

王娅，刘丽娅，谢彩云，马晓菁，叶锋，谷文喜，马俊杰，钟旗，易新萍*

(1. 新疆畜牧科学院兽医研究所/新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心，新疆 乌鲁木齐 830000；2. 新疆农业大学动物医学学院，新疆 乌鲁木齐 830000)

莱姆病是一种由伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)感染引起，经硬蜱叮咬吸血时进行传播的自然疫源性人畜共患病[1]。可侵害人体多系统及脏器，临床表现多样化。该病分布广、传播快、致残率高，近年来疫源地及发病率均呈现出扩大和上升趋势，已成为严重的世界性公共卫生问题[2-3]。

收稿日期：2019-08-29；修回日期：2020-04-07

基金项目：国家重点研发计划项目(2017YFC1200500)

第一作者：王娅(1997-)，女，硕士研究生；刘丽娅(1984-)，女，硕士，副研究员。#共同第一作者

*通信作者：易新萍，研究员，研究方向为动物传染病，E-mail：821489803@qq.com。

新疆的气候条件、植被资源为蜱虫的孕育及蜱传疫病的传播提供了良好的生态条件，是我国莱姆病的重要疫区[4]。据报道至少能在 35 种蜱和少数吸血蚊、蝇、虻、螨、蚤类体内分离到莱姆病螺旋体，但具有保持和传播莱姆病螺旋体能力的只有硬蜱类[5]。本研究选择伯氏疏螺旋体5S-23S rRNA基因间隔区设计特异性引物，建立莱姆病套式PCR检测方法，对2018—2019年采集的硬蜱样本进行检测，以此来了解新疆北疆地区硬蜱携带伯氏疏螺旋体的流行现状，以期为疫病的防控提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

伯氏疏螺旋体B31标准株(ATCC35210)、大肠杆菌标准株(CVCC1531)、沙门菌标准株(CVCC3762)、钩端螺线体基因组DNA(DSM21537)均由新疆畜牧科学院兽医研究所保存。

1.1.2 试剂

PCR Mix，北京庄盟生物技术有限公司；1×PBS稀释液、TE稀释液、DNA Marker，上海生工生物工程技术服务有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技有限公司；BSK培养基，美国Sigma公司；LB培养基，北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 对照样品DNA的提取

将伯氏疏螺旋体B31标准株、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌进行培养后，按细菌基因组DNA提取试剂盒操作说明分别提取DNA。

1.2.2 套氏PCR检测方法

1.2.2.1 引物设计与合成

在伯氏疏螺旋体5S-23S rRNA基因(GenBank登录号JX564636.1)间隔区设计套式PCR引物，并委托昆泰锐生物技术有限责任公司合成，引物序列见表1。

表1 5S-23S rRNA间隔区套式PCR引物序列

名称引物序列(5'→3')退火温度/℃片段大小/bp23SN1ACCATAGACTCTTACTTTGAC23SC1TAAGCTGACTAATACTAATTACCC5538023SN2ACCATAGACTCTTATTACTTTGACCA5SCBGAGAGTAGGTTATTGCCAGGG62225

1.2.2.2 反应体系

进行2轮PCR反应，每轮体系均为25 μL：包括2×TaqMasterMix 12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，双蒸水8.5 μL，第1轮模板为2 μL，第2轮模板为第1轮PCR产物2 μL。

1.2.2.3 反应条件

第1轮PCR使用引物为23SN1和23SC1，扩增程序如下：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；再72 ℃延伸10 min，16 ℃终止反应。第2轮PCR使用引物为23SN2和5SCB，扩增程序如下：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40个循环；再72 ℃延伸10 min，16 ℃终止反应。

1.2.2.4 产物检测

用TAE电泳稀释液配置1%琼脂凝胶，取5 μL套式PCR扩增产物分别加入样品孔，以100 V恒压电泳，采用凝胶成像系统拍照，阳性可见约为225 bp左右的条带。

1.2.2.5 敏感性试验

将提取的伯氏疏螺旋体B31标准株DNA应用分光光度计进行含量测定，稀释至1 ng/μL后进行10倍系列稀释，浓度分别为10-1、10-2、10-3、10-4ng/μL，取2 μL为模板进行套式PCR 扩增，以检测其敏感性。

1.2.2.6 特异性试验

以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、钩端螺旋体、伯氏疏螺旋体B31标准株DNA为模板，进行套式 PCR 扩增以检测其特异性。

1.2.3 检测蜱虫样本DNA提取

在新疆伊犁地区、阿拉山口、呼图壁县、青河县、福海县和五家渠县采集游离蜱和吸血蜱共534只。将蜱浸泡于75%酒精中15 min，再用1×PBS稀释液或生理盐水清洗3次，放置于干净的滤纸上吸水干燥。干燥后用镊子将蜱夹放在无菌载玻片上纵切，加适量TE进行研磨，煮沸10 min，8 000 r/min离心5 min后取上清，保存于-20 ℃用于检测。

2 结果

2.1 套氏PCR敏感性及特异性

2.1.1 敏感性

应用建立的套式PCR检测方法，对稀释后的伯氏疏螺旋体B31标准株DNA进行扩增，电泳后检测，其检测限约为1.0×10-3ng/μL，结果如图1所示。

2.1.2 特异性

应用建立的套式PCR检测方法，以伯氏疏螺旋体标准菌株B31和金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、钩端螺旋体的DNA为模板进行扩增，电泳后显示，除伯氏疏螺旋体标准菌株B31扩增出225 bp大小的目的条带，其他未见条带，结果如图2所示。

2.2 螺旋体的检测

应用建立的套式PCR检测方法，对在新疆北疆6个地区采集的534只硬蜱进行检测，共检出81份阳性，总阳性率为15.17%。其中青河县检测蜱110只，阳性26只，阳性率最高为23.64%；福海县检测蜱18只，全为阴性；其余地区阳性率由高到低依次为呼图壁县22.73%、阿拉山口市18.06%、伊犁地区17.75%、五家渠县2.5%，具体结果见表2、图3。

M.DL2000 DNA Marker；1.阴性对照；2～7.伯氏疏螺旋体标准菌株B31阳性质粒阳性对照(1 ng/μL)、100、10-1、10-2、10-3、10-4ng/μL

图1 套式PCR敏感性检测

M. DL2000 DNA Marker；1.伯氏疏螺旋体标准菌株B31；2.金黄色葡萄球菌；3.大肠杆菌；4.沙门菌；5.钩端螺旋体

图2 套式PCR特异性检测

表2 蜱样本巢氏PCR 检测结果

采样地检测数阳性数阳性率/%伊犁地区4县市1602213.75阿拉山口市1442618.06呼图壁县22522.73青河县1102623.64福海县1800.00五家渠县8022.50总 计5348115.17

M. DL2000 DNA Marker；1.伯氏疏螺旋体标准菌株B31；2.阴性对照；3～17.检测蜱样本

图3 部分蜱样本套式PCR检测结果

3 讨论

莱姆病诊断的“金标准”是从样本中分离出伯氏疏螺旋体，但其体外分离培养难度大，耗时长、成本高、易污染，且分离率较低。血清学检测方法敏感性和灵敏性又不高，因而分子生物学检测方法越来越多的被应用于莱姆病的检测。套式PCR(Nested-PCR)是一种普通PCR的优化模式，原理是设计2对引物，第2对引物在第1对引物的内部，将第1轮PCR的产物作为第2轮PCR的模板进行扩增[6]。其敏感度和特异性均高于普通PCR，被认为是临床检测螺旋体菌属最敏感的方法之一[7]。本研究选择伯氏疏螺旋体5S-23S rRNA基因间隔区成功设计嵌套式引物，以此为基础建立了套式PCR检测体系，评估了该方法的敏感性和特异性，并成功应用于检测临床样本。

自1987年以来，新疆已先后被证实存在多个莱姆病自然疫源地[8-10]。莱姆病通过蜱作为媒介进行传播，要深入地探讨莱姆病的发生与传播的机制，首先需要了解各地蜱伯氏疏螺旋体的带菌情况。本研究对新疆北疆6个地区采集的硬蜱携带伯氏疏螺旋体流行现状进行调查，结果显示6个地区硬蜱伯氏疏螺旋体平均携带率为15.17%。其中青河县最高，达23.64%，福海县未检测到。不同地区间存在差别，与采集的样本数量有关，也可能与采集区域是否是疫源地或莱姆病高发区有关[11]。

牛、羊、犬、兔、鹿和鼠等动物均可感染莱姆病，又通过蜱叮咬后传播给人，该病对人类健康和畜牧业发展已构成极大危害。鉴于此次调查得知新疆北疆地区蜱莱姆病伯氏疏螺旋体携带率较高，应加强莱姆病的防控工作，长期开展蜱虫分布及蜱传疫病检测监测，了解其传播和流行风险，及时预警预报。同时，应做好灭蜱工作，对长期在野外、户外及蜱栖息地、莱姆病疫源地停留的人员，要加强莱姆病防控知识的科普宣传，提高自我防护意识。