猪内源性逆转录病毒及其敲除抑制方法

张健民 李 阳

（1.南方医科大学珠江医院再生医学研究所，广东 广州，510282；2.南方医科大学珠江医院肝胆二科，广东 广州，510282）

引言

目前，供体的极度短缺是器官移植所面临的最大的障碍，很多患者在等待供体器官中死去。虽然国家采取了多项措施用于鼓励和推广器官捐赠，但并没有有效解决我国器官供体严重短缺现象。目前，异种器官移植被认为是解决供体器官短缺现状的一种有效方法。其中，猪由于具有以下优点：1、猪的心血管系统、消化系统、皮肤、营养需要、骨骼发育以及矿物质代谢等都与人的情况极其相似；2、猪的主要脏器器官与人类大小相近；3、猪基因多样、繁殖周期短、生产力高，一窝产仔多，便于根据特殊需要进行选育；因此，被认为是异种移植器官组织来源的最佳供体。但使猪成为异种移植器官供体仍有很多障碍需要克服，这主要包括免疫排斥和致病微生物的传播。早在十几年前科学家就开始对猪进行免疫学改造，以解决免疫排斥问题。对于猪体内的病原微生物，其绝大多数真菌、细菌、病毒可通过SPF级培育净化去除，但猪基因组内存在的PERV难以通过净化培育去除。本文对PERV的特征及抑制其表达的方法进行了综述。

1 PERV简介

1.1 PERV分子特性：

PERV的基因组为单股正链线性RNA，长约7-9kb，由两端的非编码区和中间的gag、pol、env三个编码区组成。Gag编码病毒的核心蛋白；pol基因编码病毒复制所需的酶类，主要有蛋白酶（PR）、逆转录酶（RT）和整合酶（IN）；env基因编码囊膜糖蛋白，主要包括表面蛋白（SU）gp70和穿膜蛋白(TM)p15E。根据PERV env基因编码的不同，可以将PERV分为三个亚型：PERV-A、PERV-B、PERV-C，其差异主要在于SU表面糖基化的VRA、VRB和PRO区，这种差异可能导致不同类型的PERV有着不同的宿主感染范围。

PERV的基因序列不保守：巴马小型猪PERV（PERV-BM）株为进化株A亚型的进化分支[1]，以PERV-BM基因序列为基准，将其与GenBank数据库公布的17株不同亚型的PERV序列进行全基因序列同源性比对分析，结果表明PERV-BM与同样来自中国的EF133960 CA亚型)同源性最高，为97.1%；与英国的KC 116219 C同源性最低，为88.4%，PERV呈现不保守性。

图1 PERV-巴马株与其它各亚型PERV之间的核苷酸序列同源性比较（1）

图2 PERV巴马株的系统进化树分析（1）

1.2 PERV的分布：

PERV在不同猪种和组织中分布情况不同。对PERV感染和分布情况可以通过直接检测病毒DNA、病毒mRNA及相关病毒蛋白的存在来证明PERV感染，也可通过检测病毒产物来间接证明存在PERV病毒感染[2][3][4]。利用PCR、实时PCR[5][6][7]、Southern blot[8]等方法可以直接检测出病毒前DNA的存在；通过对PERV设计引物和探针还可以直接检测出细胞中PERV的拷贝数[9]；通过FISH可检测出PERV前DNA在染色体中的位置[10][11]；PERV所表达RNA的水平可通过RT-PCR的方法进行检测[12]；其相关蛋白的表达，可通过 Western blot、免疫组化等方法进行检测[13][14]。通过检测RT等酶的活性可以间接验证PERV的存在[15]。Sai P.[16]等通过western blot和RT-PCR等方法从蛋白和mRNA水平对不同猪种、不同脏器组织中PERV的表达进行了检测，发现PERV表达水平都不尽相同。以Q-PCR等方法检测不同猪种组织脏器中PERV前DNA拷贝数，发现不同猪种不同组织来源细胞中PERV前DNA拷贝数也不相同（表1）。

表1 各种猪源组织细胞中PERV拷贝数

猪基因组学研究显示在猪的基因组中PERV前DNA拷数为10到100[8][21][22][23]不等，Ramis G[24]等验证了PERV的拷贝数与猪的杂合性无关联。对六种不同的猪亚种（Large White pig、Westran pig、Korean pig、Wild boar、Yucatan mini pig、d/d mini pig）猪基因组中的PERV 分布情况进行检测，发现PERV可存在于猪的各条染色体上，在每个染色体中的 拷贝数在0-5之间，但其在每条染色体上的分布规律尚未发现。[25][26][27][28][29][30]。Clemenceau B[16]等还对SPF培育猪中PERV mRNA的表达量进行了检测，发现所有组织中均可检测到PERV的表达。其中，以肾脏中PERV的表达量最高，肝脏、肺和心脏其次，胰脏中PERV的表达量最低。PERV在不同组织表达量的差异是由于PERV的LTR在不同组织中转录活性的不同造成的[31][32]。SPF猪和普通猪中PERV的表达量没有明显的差异，说明SPF培养不能够去除猪基因组中的 PERV，SPF猪并不能够降低异种移植时PERV传染给人的风险。

1.3 PERV的感染过程：

首先，PERV的跨膜蛋白先与靶细胞膜融合，使病毒的核心部分进入靶细胞内。在逆转录酶的作用下，病毒基因组RNA复制形成双链的DNA，双链DNA再在整合酶的作用下整合到靶细胞基因组中，并以前DNA的形式存在。PERV前DNA成为细胞基因组的永久成分，随宿主细胞DNA的复制而复制。前病毒DNA可以在宿主细胞RNA聚合酶II的作用下，转录生成病毒RNA，再经过加工形成mRNA。在mRNA的指导下进一步形成病毒相关蛋白，主要包括核心蛋白、表面蛋白、穿膜蛋白以及功能酶类（蛋白酶、反转录酶、整合酶）。待病毒RNA基因组和结构蛋白都形成后，病毒就开始自我装配，并以出芽的方式从细胞膜上释放出来，感染其他细胞。

1.4 PERV的感染特性：

现已证实，多种类型的猪细胞都存在PERV感染，可以释放PERV病毒颗粒，在体外培养条件下PERV可以感染多种人源细胞[33]。PERV-A和PERV-B的宿主范围较宽，不仅可以感染猪、貂等动物细胞，也可以感染人类的293、TE671、Hela、U87等细胞系；PERV-C目前仅发现它可以感染2种猪细胞系和一种人细胞系；PERV-A和PERV-C会形成重组体PERV-A/C，其感染人细胞的能力远高于PERV-A。因此，宜选择PERV-C阴性猪作为异种器官移植的供体来源。Luc JW等研究表明PERV能够跨物种间体内感染。他们先进行了体外培养条件下，跨物种间细胞感染实验，发现猪的胰岛细胞可释放PERV颗粒，并能够感染体外培养人细胞，。之后他们将猪的胰岛移植入NOD/SCID鼠体内(非肥胖糖尿病鼠伴严重的免疫功能低下)，在移植后的鼠脾、肝、肾、小肠等若干组织细胞内都检测到了PERV的表达[34]。对于PERV在体内条件下能否感染人体组织细胞，Paradas等对160名接受猪活体组织治疗的患者进行了PERV感染情况的追踪调查，其中脾灌流100人，猪源性生物人工肝HEPAT Assist仪治疗28人，猪皮移植15人，猪胰岛细胞移植14人，体外肾灌流2人，猪整肝灌流1人，追踪调查的这12年内，这些患者均未出现病毒血症；对PERV感染进行检测，有159人(97%)未检出PERV感染，有23人存在微嵌合(PERV DNA及猪特异DNA双阳性)，继续观察8.5年，均未有PERV感染发生[35]。虽然PERV能否感染人体组织细胞仍然存在争议，但目前尚不能排除猪器官移植人体后存在PERV感染的风险。猪器官移植灵长类后，最长存活时间已超过365天，还未有猪器官中PERV在长期条件下，是否会感染灵长类的研究。目前也没有更多猪器官移植人体及其PERV感染情况的报道。为了避免猪器官移植人体后存在PERV感染的风险，有必要去除猪基因组中PERV基因，以解除PERV感染人体的风险，为异种移植奠定基础。

2 PERV的抑制和消除

目前，对PERV进行抑制和消除的方法主要有三种，包括1）通过抑制病毒反转录酶和整合酶活性抑制PERV的感染；2）通过RNAi的方法抑制PERV的表达；3）通过基因编辑技术对基因组中PERV的前DNA序列进行敲除。

图3 PERV感染过程及其抑制和消除

2.1 反转录酶（RT）和整合酶（IN）活性的抑制：

PERV的Pol编码区编码病毒所需的多种酶类，其中最主要的三种为：蛋白酶、反转录酶、整合酶。通过抑制病毒复制、整合所需酶类的活性，可抑制病毒感染。

2.1.1 整合酶活性的抑制：

整合酶的作用是将PERV的前DNA整合到宿主基因组中。目前已证明二酮酸类化合物可抑制细胞内整合酶活性。其作用机制是二酮酸类化合物可以与病毒DNA和整合酶结合所形成复合物催化核心区域中的二价金属相结合，从而阻止了复合物与宿主DNA的结合，抑制了病毒DNA与宿主DNA的整合。

雷特格韦（Raltegravir、RAL）是一种常用整合酶抑制剂，RONFORT Corinne[36]等分别在分子水平和细胞水平证实了RAL能够有效抑制PERV整合酶的活性。在分子水平，当RAL的浓度达到400nM时，IN活性下降90%；细胞水平，在10nM RAL浓度处理下感染了PERV的293T细胞在经过了39天的处理后感染了PERV的比例几乎为零，而对照组中的感染了PERV的293T细胞达到了100%。说明了RAL能够有效的抑制PERV整合酶活性。

2.1.2 反转录酶活性的抑制：

反转录酶具有多种酶活性，现已被证明其具有聚合酶活性和RNA H活性。聚合酶可以以DNA或RNA为模板，合成一条新的DNA链，RNA酶H再特异性的降解RNA-DNA双链中的RNA链。逆转录酶抑制剂可以抑制病毒RNA的复制，从而抑制PERV的表达。逆转录酶抑制剂主要包括两种：核苷类逆转录酶抑制剂（NRTIS）和非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIS)。

Joachim Denner、F.X.Wilhelm、WALID HENEINE[37][38][39]等研究者检测了十余种NRTIS和NNRTIS对PERV逆转录酶的抑制效果，其中AZT和ddGTP效果较明显，AZT的浓度达1uM时，逆转录酶活性最低。

2.2 RNAi抑制PERV的表达

RNA干扰是生物界普遍存在的一种抵御外来基因和病毒感染的保守进化机制，其本质是siRNA与靶向mRNA特异性结合，并由RISC介导mRNA降解，从而沉默靶向基因。

许多研究者利用siRNA干扰降解PERV编码区mRNA从而抑制PERV的表达。Joachim Denner、Y GAO[40][41]等针对PERV编码区的相对保守区域gag、pol序列设计siRNA，用来抑制PERV的表达，并通过RT-PCR验证了各个siRNA干扰PERV表达的效率，发现siRNA pol2的抑制效果最显著。

Ryota Shirakura、David Ayares、Joachim Denner、Y GAO[40][41][42][43][44]等十余研究团队都成功利用siRNA有效的抑制了PERV的表达。Joachim Denner等使用慢病毒载体携带siRNA-pol2转染猪成纤维细胞，转染后的成纤维细胞较对照组PERV的表达量明显降低。他们再利用体细胞核移植技术以PERV抑制细胞为供体，制作出了克隆猪。该克隆猪所有的组织器官基因组中都可检测出siRNA-pol2的转入，并且克隆猪PERV的表达量也较野生型猪有显著降低。他们再以分出的阳性猪成纤维细胞进行再克隆，再克隆猪PERV的表达量较对照组也有显著下降。

2.3 PERV敲除

由于PERV在猪基因组中拷贝数较多，利用传统敲除方法无法实现完全敲除，之前研究多利用RNAi技术对PERV表达进行抑制。在ZFN、TALEN、Crispr/Cas9等高效基因编辑技术之后，使对PERV的完全敲除成为可能。

2.3.1 ZFN敲除PERV序列

Joachim Denner[45]等首先使用ZFN敲除细胞系中的PERV。转染后的细胞系中可检测到ZFN的表达，但是较对照组相比PERV拷贝数以及其mRNA表达量无明显差异。ZFN未能有效的敲除细胞系中PERV，这可能是由于ZFN打靶效率相对较低导致的。

2.3.2 Crispr/Cas9敲除PERV

Crispr/Cas9打靶技术出现后，George Church、Luhan Yang[19]等利用CRISPR/Cas9技术成功的灭活了PK15细胞中的多达62个拷贝的PERV序列。他们针对PERV保守序列pol区设计gRNA后连入PB转座子载体中，构建成PB-Cas9/2gRNAs载体。将PB-Cas9/2gRNAs载体转入PK15细胞，PK15细胞可持续高效的表达靶向PERV序列Cas9和gRNA，从而导致PK15细胞中的62个PERV拷贝全部发生了碱基的插入或者缺失。被基因编辑的PK15细胞丧失了感染HEK293细胞的能力，62个PERV拷贝全部被灭活。

3 结论

PERV是已整合在猪的基因组中的内源性逆转录病毒，整合酶抑制剂、逆转录酶抑制剂、siRNA干扰等方法都能在一定程度上抑制的PERV的表达。但是通过这些方法，只是抑制了PERV的表达，PERV前DNA仍然存在与猪的基因组中，其潜在危险性仍未被去除。利用ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等基因编辑技术对其进行敲除时，由于PERV基因序列的不保守性，即使在相对保守的gag、pol区域仍有许多不保守的序列，增加了将其从猪基因组中完全去除的难度。并且PERV有较强的自我修复能力，敲除的碱基数小于10bp，或其拷贝数敲除不完全时，可能只发生短暂的失活或表达降低，在残余PERV序列作用下，又迅速恢复其活性。因此，在个体水平对PERV进行完全敲除，制作无PERV的异种器官移植供体猪仍存在很多困难。George Church等已成功利用Crispr/Cas9技术将PK15细胞中62个拷贝的PERV失活。Crispr/Cas这一高效基因打靶技术的出现，使在个体水平对猪PERV序列进行完全敲除成为可能。今后，可以以同样的技术对体细胞PERV进行敲除，获得无PERV的体细胞后，再进行克隆猪制作，以获得无PERV猪。笔者所在实验室已通过CRISPR/Cas9技术实现了对猪的基因修饰，并已培育出基因修饰猪30多种[46][47]，目前正在进行无PERV猪的培育工作。无PERV猪培育成功后将极大推动异种器官移植的发展。