基于正交试验法对舒血宁注射液溶媒配伍方案的优选

王 羿，周 雪，聂毓恬，苓 丽，沈祥春，陶 玲*

0 引言

舒血宁注射液是由银杏叶提取物精制而成的中药注射剂，其活性成分主要包含黄酮苷、银杏内酯等，具有扩张血管、改善微循环、增强机体免疫功能的作用，适用于冠心病、心绞痛、脑栓塞、脑血管痉挛、缺血性心脑血管等疾病的治疗[1-3]，是临床应用较广泛的中药注射液之一。

近年来，随着舒血宁注射剂在临床中的广泛应用，其不良反应也日益增多，严重影响治疗效果[4]。研究显示，该药的不良反应除了与患者个体差异、滴注速度、制备工艺、单次剂量和使用说明书外的方法有关外，还与配伍液配伍后引起稳定性发生变化的因素有关[5-6]。目前，在舒血宁注射液与溶媒配伍后稳定性的研究方面，既往研究主要集中于溶媒种类、放置时间的影响，且均是通过单因素来进行考察，忽视了温度、溶媒体积等因素的影响[7]。药物的稳定性受多种因素的影响，而对于多因素共同作用下舒血宁注射液溶媒配伍稳定性研究至今未见文献报道。

为了保证临床用药安全，提高成品输液质量，本课题采用单因素结合多因素设计，以槲皮素、异鼠李素、山奈素成分为指标，优选最佳调配方法，并考察该方案下配伍液0～4 h内不溶性微粒数，为舒血宁注射液静脉用药的合理性提供数据支持，为调配后的输液剂质量控制提供参考。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 Ultimate 3000高效液相色谱仪(美国赛默飞公司)；ME104/02型电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；UPW-UP-10型超纯水机(成都天莘宁有限公司)；色谱柱：LP-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；GWF-5J智能微粒检测仪(天河医疗仪器有限公司)；DZKW-4型电热恒温水浴锅(上海科析试验仪器厂)。

1.2 试剂 舒血宁注射液(规格：2 ml，黑龙江珍宝岛药业股份有限公司，批号：A04171004058)；槲皮素对照品(规格：20 mg，批号：HQ231704198，纯度≥98%)，山奈素对照品(20 mg，批号：HA06211819，纯度≥98%)，异鼠李素对照品(规格：20 mg，批号：HI086347198，纯度≥98%)，均购自宝鸡市晨光生物科技有限公司；0.9%氯化钠注射液(规格：100 ml，NS，批号：E218082702)、5%葡萄糖注射液(规格：100 ml，5%Gs，批号：E218020107)、10%葡萄糖注射液(规格：500 ml，10%Gs，批号：E17082403)，均购自贵州科伦有限公司；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性 色谱条件：Ultimate®LP-C18柱(4.6 mm×250 mm，0.5 μm)，流动相:甲醇(A)-0.3%磷酸(B)=53∶47，柱温为35 ℃，流速为1.0 ml/min，检测波长为360 nm，进样量20 μl。

系统适应性：在上述色谱条件下，槲皮素、异鼠李素、山奈素峰的出峰时间分别为9.7、17.5、32.9 min，理论塔板数按槲皮素计不低于8 000；相邻色谱峰的分离度均大于1.5，空白对照未见干扰，见图1。

图1 高效液相色谱图

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取槲皮素、异鼠李素、山奈素对照品适量，加甲醇制成每1 ml含0.2 mg的对照品储备液。分别精密吸取上述对照品储备液1 ml于10 ml容量瓶中，加甲醇-0.3%磷酸(1∶1)混合溶液定容，制成每1 ml含20 μg的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 模拟舒血宁注射液临床用量，精密量取舒血宁注射液及溶媒进行配伍，将配伍液取2 ml放置于圆底烧瓶中，加甲醇-30%盐酸(3∶1)混合溶液4 ml，85 ℃回流60 min，冷却至室温，将所得液体吸入10 ml容量瓶中，甲醇定容，得供试品溶液。

2.2.3 空白对照溶液的制备 未加舒血宁注射液的溶媒按照供试品溶液制备方法制备所得。

2.3 线性关系考察 精密量取“2.2.1”项下各对照品溶液，分别置于5 ml容量瓶中，用甲醇-0.3磷酸(1∶1)混合溶液定容。此时浓度分别为：槲皮素0.24、0.48、0.96、1.92、3.84、7.68 mg/L，异鼠李素0.16、0.32、0.64、1.28、2.56、5.12 mg/L，山奈素0.56、1.12、1.68、2.24、2.8、3.36 mg/L。按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以对照品浓度(X，mg/L)为横坐标，各色谱峰的峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归，绘制标准曲线，计算回归方程。结果表明，槲皮素、异鼠李素、山奈素的浓度在各自范围内与峰面积呈良好的线性关系。见表1。

表1 3种成分的回归方程与线性范围

2.4 精密度试验 取“2.2.1”项下各对照品溶液适量，按照“2.1”项下色谱条件连续进样，测定6次，记录色谱峰面积。结果显示，槲皮素、异鼠李素、山奈素色谱峰RSD分别为1.5%、1.7%、2.6%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验 取舒血宁注射液20 ml，分别加入100 ml的5%Gs、10%Gs、NS中，按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，取各溶液于0、2、4、6、8、24 h按照色谱条件依次进样测定，记录峰面积。结果显示，6 h及之前测量时，各成分RSD均在要求范围内；6 h后，5%Gs中山奈素RSD为5.5%，大于要求范围，故供试品溶液在6 h内稳定性较好。

2.6 加样回收率试验 用5%Gs、10%Gs、NS分别配制9份主要成分含量已知的溶液，分别加入低、中、高(50%、100%、150%)3个不同剂量的对照品，各3份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项色谱条件进样测定，记录峰面积，计算加样回收率，结果表明，该方法准确可靠。见表2。

表2 加样回收率检测结果(n=3)

2.7 含量测定

2.7.1 正交试验 以槲皮素、异鼠李素、山奈素含量为考察指标，选择温度、溶媒种类和溶媒体积3个因素，每个因素3个水平按L9(34)进行实验，正交试验设计见表3。

表3 因素水平表

2.7.2 含量测定试验结果及方差分析 精密吸取舒血宁注射液，按表3正交试验设计和表4试验方案安排试验，将所得配伍液按“2.2.2”项下方法制备成供试品溶液，分别进样检测，记录峰面积并计算相对含量。以槲皮素、异鼠李素、山奈素相对含量为综合评价指标，采用主观权重系数法来进行权重系数分配。根据各指标对注射液药效贡献的大小给予权重系数分配，均为1/3。结果见表4，方差分析见表5。

结果表明，各因素对舒血宁注射液与溶媒配伍稳定性的影响均有统计学意义，影响大小为C>A>B，确定最佳配伍方案为A2B1C2，即温度25 ℃，5%Gs注射液250 ml作为溶媒。

2.8 验证试验 按照正交试验优选的配伍条件，配制3份供试品溶液，分别于0、2、4、6、8 h测定槲皮素、异鼠李素、山奈素相对含量(以表4中各成分最高含量为100%计)，结果见表6。0 h测量结果表明，选出的配伍方案稳定，重现性良好；4 h后测量，槲皮素和山奈素的相对含量下降超出10%。

2.9 不溶性微粒检测 按照2015年版《中国药典》四部微粒检查法中的光阻法[8]，用智能微粒检测仪检查不溶性微粒。

2.9.1 空白试验 根据正交试验优选的配伍条件，取舒血宁注射液和5%Gs，各3份测定其不溶性微粒，取平均值。结果见表7，表明本次试验所用注射液和溶媒均符合规定。

2.9.2 样品溶液微粒测定 根据配伍方案制备供试品溶液，于4 h内进行不溶性微粒检测，每个供试品重复3次，取平均值，结果见表7。

表4 正交试验结果(n=3)

注：以各成分最高含量为100%计算相对含量

表5 方差分析

注：F0.05(2,2)=19，F0.01(2,2)=99

结果表明，4 h内配伍液的不溶性微粒数无明显变化，均符合临床用药要求。结合“2.8”项下结果，为保证临床用药的有效性及经济性，建议临床对舒血宁注射液与5%Gs配伍的使用最好是在4 h内滴完。

表6 不同时刻各主要成分含量(n=3)

注：A.槲皮素，B.异鼠李素，C.山奈素

表7 两药配伍前后不同时间点不溶性微粒数(n=3，个/ml)

3 讨论

中药注射液的稳定性与其临床应用密切相关[9]。中药注射液成分复杂，稳定性低，当与溶媒配伍后，容易发生氧化、水解、聚合反应，或者由于配伍引起pH值变化而析出，形成不溶性微粒，导致有效性及安全性均受影响，从而影响临床用药，所以对于中药注射液使用的溶媒选择及配伍后的存放要求较高[10-11]。

本试验首先通过多因素的正交试验得出，对于舒血宁配伍液中3个主要成分含量，溶媒体积、温度、溶媒种类对其影响均有统计学意义，其中溶媒体积的影响最大。初步优选的配伍条件为25 ℃下用5%Gs 250 ml配制。在此基础上，单因素考察放置时间对有效成分含量的影响。依据《药品注射剂使用指南》2008年版有关规定，在静脉注射液中大于10%的有效成分被分解，则认为该药品与输液不宜配伍。结果显示，舒血宁注射液在与5%Gs配伍4 h后，其有效成分含量下降超出10%，说明4 h后的配伍液不稳定，建议该配伍液在4 h内滴注完毕。最后，通过检测4 h内优选配伍条件下供试品溶液的不溶性微粒数量，结果显示，4 h内溶液不溶性微粒在药典规定的范围内，说明该配伍满足注射液质量要求。

综上所述，对于临床舒血宁注射液使用最优配伍方案为25 ℃下用5%Gs 250 ml配制，建议4 h内使用完毕。该方案与药品说明书基本一致，所以在药品使用过程中，应该严格按照说明书用药，尤其是老年患者，大多数具有多种疾病，脏器功能减弱，对药物代谢能力差，更易发生不良反应[12-13]。

本试验通过多因素的正交试验结合单因素优选配伍方案，避免了因单因素考察而忽略多因素之间的共同作用。虽然说明书有明确的配伍方案，但临床上很多医生并没有按照说明书使用该药而引起不良反应，也可能影响其疗效。本文除了对说明书上的使用方法提供科学依据以外，还补充了说明书上没有的配伍后最佳使用时间的范围，为该药临床使用的安全性及有效性提供了一定的参考价值，指导临床医务人员合理用药，减少不良反应的发生，同时在一定程度上也降低了医务人员对患者疾病治疗上的难度，利于治疗时间的缩短，降低患者治疗成本。