HPLC波长切换法同时测定杜仲双降袋泡剂中7种成分的含量

李黎丽，何胜利

0 引言

杜仲双降袋泡剂[1]收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第十二册，由杜仲叶、苦丁茶两味中药材加工而成，具有降压、降脂的功效，主要用于高血压及高血脂症的治疗。现行质量标准未对方中的任何成分进行定量测定。张小萍等[2]对杜仲双降袋泡剂所含绿原酸进行了测定。中成药复方制剂所含各成分的最大吸收波长不同，单一波长难以同时准确测定多组分的含量。本文采用HPLC波长切换技术，选取所测各成分桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、芦丁和槲皮素的最大吸收波长进行测定，提高了检测的灵敏度和准确性，建立了HPLC波长切换法同时测定杜仲双降袋泡剂中桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、芦丁及槲皮素含量的方法，为杜仲双降袋泡剂中多种成分含量控制提供了试验依据。

1 仪器与试药

Agilent 1220高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；AG135电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]。杜仲双降袋泡剂(规格：每袋装3.5 g，批号：160702、170305、170512)来源于贵州神奇药业有限公司。对照品京尼平苷酸(111828-201604，含量97.4%)、绿原酸(110753-201716，含量99.3%)、桃叶珊瑚苷(111761-200601，含量100.0%)、松脂醇二葡萄糖苷(111537-201706，含量91.7%)、芦丁(100080-201610，含量91.9%)、槲皮素(100081-201610，含量99.1%)来源于中国食品药品检定研究院；对照品京尼平苷(24512-63-8，含量98.0%)来源于上海纯优生物科技有限公司；甲醇为色谱纯，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用Hydrosphere C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)色谱柱；流动相A：乙腈，流动相B：0.1%磷酸溶液，梯度洗脱(0～15 min，11.0%A；15～31 min，11.0%A→42.0%A；31～38 min，42.0%A→54.0%A；38～45 min，54.0%A→11.0%A)；检测波长：208 nm[3-4](0～15 min，检测桃叶珊瑚苷)、235 nm[5](15～31 min，检测京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷和松脂醇二葡萄糖苷)、270 nm[6](31～45 min，检测芦丁和槲皮素)；流速：0.9 ml/min；柱温：30 ℃；进样量为10 μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、芦丁、槲皮素对照品适量，用80%甲醇分别制成单个成分的对照品储备液(各成分质量浓度分别为桃叶珊瑚苷2.194 mg/ml、京尼平苷酸1.956 mg/ml、绿原酸1.372 mg/ml、京尼平苷0.494 mg/ml、松脂醇二葡萄糖苷1.622 mg/ml、芦丁0.918 mg/ml、槲皮素0.370 mg/ml)；依次吸取上述对照品储备液各适量，用80%甲醇制成混合对照品溶液(各成分质量浓度分别为桃叶珊瑚苷109.7 μg/ml、京尼平苷酸97.8 μg/ml、绿原酸68.6 μg/ml、京尼平苷24.7 μg/ml、松脂醇二葡萄糖苷81.1 μg/ml、芦丁45.9 μg/ml、槲皮素7.4 μg/ml)。

2.2.2 供试品溶液的制备 取杜仲双降袋泡剂约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇50 ml，密塞，称定重量，加热回流1 h，放冷至室温，擦干外壁，用80%甲醇补足减失重量，摇匀，过滤，续滤液作为杜仲双降袋泡剂供试品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 杜仲双降袋泡剂由杜仲叶、苦丁茶两味中药材加工而成，杜仲叶主要含有桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、芦丁、槲皮素等成分，苦丁茶主要含有芦丁和槲皮素等成分。该制剂生产过程中未加入任何辅料，同时本文所测定成分中的芦丁和槲皮素为杜仲叶、苦丁茶的共有成分，故采用样品制备溶剂80%甲醇作为阴性样品溶液。

2.3 系统适用性试验 精密量取“2.2.1”～“2.2.3”项下混合对照品溶液、杜仲双降袋泡剂供试品溶液、阴性样品溶液各适量，依法进样分析，结果显示，阴性对测定无干扰，理论塔板数按照所测各成分色谱峰计均不低于3 500，所测各成分桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、芦丁、槲皮素峰形对称，分离度均大于1.5，色谱图见图1。

2.4 线性范围试验 分别精密吸取“2.2.1”项下对照品储备液各0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ml，分别置于6个20 ml量瓶中，用80%甲醇稀释至刻度，摇匀，制成所测各成分25倍浓度差的6个混合对照品溶液，依法进样测定桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、芦丁和槲皮素的峰面积，以所测各成分质量浓度C为横坐标，桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、芦丁和槲皮素的峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程。见表1。

2.5 精密度考察 取“2.2.1”项下的混合对照品溶液，依法连续进样测定6次，记录桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、芦丁、槲皮素的峰面积，并计算RSD。结果所测各成分桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、芦丁、槲皮素峰面积的RSD分别为0.61%、0.78%、0.83%、1.09%、0.76%、1.02%、1.25%。

图1 HPLC色谱图

注：A.混合对照品溶液，B.杜仲双降袋泡剂供试品溶液，C.阴性样品溶液；1.桃叶珊瑚苷，2.京尼平苷酸，3.绿原酸，4.京尼平苷，5.松脂醇二葡萄糖苷，6.芦丁，7.槲皮素

表1 线性关系实验结果

2.6 重复性考察 取杜仲双降袋泡剂样品(批号：160702)，按照“2.2.2”项下杜仲双降袋泡剂供试品溶液制备方法制备6份供试品溶液，依法进样测定，记录桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、芦丁、槲皮素的峰面积，计算所测各成分含量和RSD值。结果所测各成分桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、芦丁、槲皮素含量的RSD值分别为1.05%、1.11%、0.42%、1.37%、1.20%、0.39%、1.56%。

2.7 稳定性考察 取杜仲双降袋泡剂样品(批号：160702)的同一供试品溶液，于室温下0、2、4、6、8、16 h依法进样测定所测各成分桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、芦丁、槲皮素的峰面积，并计算RSD。结果杜仲双降袋泡剂供试品溶液室温下16 h内稳定，所测各成分桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、芦丁、槲皮素峰面积的RSD分别为0.56%、0.81%、0.90%、1.05%、0.78%、1.10%、1.24%。

2.8 加样回收率试验 取已知含量的杜仲双降袋泡剂(批号：160702)6份，每份约0.5 g，精密称定，分置6个具塞锥形瓶中，每份分别精密加入0.772 mg/ml桃叶珊瑚苷对照品溶液4.0 ml、0.904 mg/ml京尼平苷酸对照品溶液3.0 ml、0.964 mg/ml绿原酸对照品溶液2.0 ml、0.714 mg/ml京尼平苷对照品溶液1.0 ml、1.157 mg/ml松脂醇二葡萄糖苷对照品溶液2.0 ml、0.643 mg/ml芦丁对照品溶液2.0 ml、0.216 mg/ml槲皮素对照品溶液1.0 ml，再按照“2.2.2”项下供试品溶液制备方法制备加样回收样品试液。依法进样检测所测各成分桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、芦丁、槲皮素含量，计算各成分的回收率及RSD值，结果见表2。

2.9 杜仲双降袋泡剂样品含量测定 取3批杜仲双降袋泡剂(批号：160702、170305、170512)，按照“2.2.2”项下杜仲双降袋泡剂制备方法制备供试品溶液，依法进样测定，记录桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、芦丁和槲皮素的峰面积，计算所测各成分含量。见表3。

3 讨论

3.1 待测成分的选择 杜仲双降袋泡剂是由杜仲叶、苦丁茶两味中药材加工而成的中成药复方制剂，杜仲叶[7]为杜仲科植物杜仲的干燥叶，主要含有酚类(包括苯丙素类)、黄酮类、环烯醚萜类、木脂素类等成分，其中绿原酸为苯丙素类主要成分，也是《中国药典》2015年版一部杜仲叶项下的定量测定指标性成分，桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸和京尼平苷为其环烯醚萜类主要化合物，松脂醇二葡萄糖苷为其木脂素类主要化合物，芦丁、槲皮素、山柰酚、异鼠李素等为其所含黄酮类主要成分；苦丁茶为木樨草科植物日本女贞的干燥枝叶[1]，主要含黄酮类、蒽醌类、皂苷类、氨基酸、糖类等成分，其中黄酮类主要有槲皮素、芦丁等。本文选取杜仲叶和苦丁茶所含的主要成分桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、芦丁、槲皮素为指标，运用HPLC波长切换技术对杜仲双降袋泡剂所含7个主要成分进行同时测定。

表2 桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、芦丁、槲皮素回收率

表3 含量测定结果(mg/g)

3.2 流动相的优化 在流动相的选择上，笔者对不同的流动相体系(甲醇-0.05%磷酸溶液[8]、甲醇-0.4%磷酸溶液[9]、甲醇-0.1%冰醋酸溶液[10]、甲醇-0.3%冰醋酸溶液[11]、乙腈-0.1%磷酸溶液[3-5]、乙腈-0.4%磷酸溶液[7])进行了对比考察，以所测各成分桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、芦丁、槲皮素的峰形、分离度以及所测各色谱峰基线是否平稳等为指标，并不断对流动相比例进行了摸索，最终优选最佳的流动相体系：以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相，按“2.1”项下色谱条件的梯度洗脱比例进行洗脱，实现了对杜仲双降袋泡剂中桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、芦丁和槲皮素的同时测定。HPLC波长切换法同时测定杜仲双降袋泡剂中的桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、芦丁、槲皮素含量的方法，操作简便，检测快速，结果准确，可用于杜仲双降袋泡剂的质量控制。