探索姜黄二酮和月桂酸共同靶基因BDKRB2在前列腺癌中的治疗意义

王庆哲，张恩崇，鞠培新，宋永胜

0 引言

目前，前列腺癌是男性健康中面临的重大问题，在男性癌症死亡原因中排名第2位[1-2]。治疗手段主要有主动监测、手术治疗、局部放射治疗、内分泌治疗、化疗等。药物治疗是癌症治疗环节中不可或缺的部分，因此，研究出有效的药物治疗方案是亟须解决的问题。天然化合物具有安全有效、毒性低、抗氧化等优势，因此，从自然化合物出发探索药物治疗方案具有重要的意义[3]。

月桂酸是富含在椰子油中的中链饱和脂肪酸，具有促进肿瘤细胞凋亡的抗癌效应[4]。姜黄二酮是姜黄中提取的化合物，在乳腺癌的治疗中已得到有效应用[5]。介于肿瘤发病因素复杂等原因，目前联合用药优于单药效果基本已成为共识。

本研究联合分析月桂酸和姜黄二酮，探索前列腺癌中新型有效的治疗靶点。应用BATMAN-TCM(a Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine)数据库分别预测月桂酸和姜黄二酮作用的靶蛋白，然后使用一系列生物信息学分析方法和工具(见图1)，最终发现BDKRB2基因与前列腺癌发生与发展的关系。

图1 流程图

1 材料和方法

1.1 预测月桂酸和姜黄二酮靶蛋白基因 应用BATMAN-TCM数据库[6]预测月桂酸和姜黄二酮的靶蛋白基因。在预测靶蛋白基因的过程中，该数据库利用化合物的结构，确定各个官能团，再通过对靶蛋白结构中的各个官能团进行比对，确定化合物以及其对应靶蛋白之间的作用关系。图2中展示了月桂酸和姜黄二酮的2D和3D结构。在BATMAN-TCM的化合物分析模块中，依次输入月桂酸和姜黄二酮的英文名称，分别获取各自的靶向蛋白基因。然后对月桂酸和姜黄二酮的靶蛋白基因取交集，得到共同靶蛋白基因。

图2 月桂酸和姜黄二酮结构

1.2 在metascape中对共同靶蛋白基因进行功能富集分析 采用metascape(http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)数据库[6-7]。将上述步骤获取的月桂酸以及姜黄二酮的共同靶蛋白基因作为基因集，输入到metascape数据库中，识别出所有具有统计学意义的富集选项。然后根据每个富集选项中基因的Kappa相似性，将各个富集选项整理为网络结构。选择Kappa相似性大于0.3作为阈值来连接各个富集选项。

1.3 选择关键基因 在“1.2”项中得到了共同靶蛋白基因的富集分析结果，根据富集分析得分，对结果进行降序排列，然后选择排名前20位的结果。然后在这20个富集选项中选择与前列腺癌发生发展相关的结果，并进行取交集操作，最终获得本研究中的关键基因。

1.4 检验关键基因在前列腺癌肿瘤组织与正常组织之间表达量差异是否具有统计学意义 采用Gene Expression Profiling Interactive Analysis(GEPIA)(http://gepia.cancer-pku.cn/)数据库[6-8]。将关键基因输入到GEPIA数据库中，设定|Log2FC|>1以及P>0.01为差异具有统计学意义的条件。最终获取在前列腺癌肿瘤组织以及正常组织之间表达量具有统计学差异的基因。

1.5 探究BDKRB2基因在前列腺癌中的生物学意义BDKRB2基因可能作为前列腺癌的治疗靶点，为了探索其在前列腺癌中的生物学意义，本研究对BDKRB2基因进行了生存分析、时间依赖性接受者操作特征曲线(Tme-dependent receiver operating characteristic curve,tdROC)分析。在生存分析中，确定无病生存时间(Disease-free survival,DFS)表示患者预后，使用Log-rank检验以及COX回归分析进行生存分析，选取BDKRB2基因的中位表达值为分割点，划分患者表达量为高表达量或者低表达量。tdROC曲线中，选择3年、5年、7年为时间节点，使用曲线下面积(Area under curve,AUC)评估BDKRB2基因对患者预后的判断能力。生存分析和tdROC曲线分析均使用R 3.5.2进行分析，其中生存分析的计算使用survival软件包，绘图使用survminer软件包。tdROC的计算及绘图均使用timeROC软件包实现。

1.6 对BDKRB2基因进行单基因GSEA分析 采用TCGA(The Cancer Genome Atlas Program)数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/)[6,9-10]中540例前列腺癌以及正常组织样本，对BDKRB2基因进行单基因GSEA分析。采用R 3.5.2 的DESeq2 软件包获取每个基因在前列腺癌组织和正常前列腺组织间的差异倍数的对数(Logarithmic fold change,LFC)，并以每个基因的LFC作为GSEA分析过程中的排序依据。从Molecular Signatures Database v7.0(http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/index.jsp)中选择C2(curated gene sets)作为本次分析用的参考基因集[11-12]。GSEA分析基于R 3.5.2 中的 clusterProfiler 软件包实现[13]。

1.7 数据统计分析 所有计算均在R 3.5.2 中实现。在功能富集分析过程中，设定校正后P<0.05时具有统计学意义。差异基因获取时，设定|Log2FC|>1以及P>0.01为差异具有统计学意义。生存分析和tdROC曲线分析过程中，选择P<0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 BATMAN-TCM数据库中月桂酸和姜黄二酮靶蛋白基因预测结果 按照BATMAN-TCM网站的说明文件，将月桂酸和姜黄二酮的英文名依次输入到数据库中，发现月桂酸具有238个靶蛋白基因，姜黄二酮具有264个靶蛋白基因。在这两种化合物的靶蛋白基因中，有24个基因为两者的共同靶蛋白基因。见图3A。

图3 对共同靶蛋白基因进行功能富集分析

2.2 功能富集分析结果 将上述过程中获得的24个靶蛋白基因输入到metascape中，得到排名前20位的富集分析结果为：GO∶0061196，真菌乳头发育；GO∶0045347，MHC Ⅱ类生物合成过程的负调控；GO∶0071407，细胞对有机环化合物的反应；GO∶0042692，肌细胞分化；GO∶0002573，骨髓白细胞分化；GO∶1905114，参与细胞-细胞信号转导的细胞表面受体信号通路；GO∶0016570，组蛋白修饰；GO∶0001664，G蛋白偶联受体结合；hsa05031，安非他命成瘾；GO∶0051480，胞质钙离子浓度的调节；GO∶2001234，凋亡信号通路的负调控；hsa04916，杀菌作用；GO∶0051090，调节DNA结合转录因子的活性；GO∶0051147，调节肌肉细胞的分化；GO∶0004842，泛素-蛋白转移蛋白活性；GO∶0042058，调控表皮生长因子受体信号通路；hsa05142，南美锥虫病；GO∶0043271，离子迁移的负调节(图3B)。在这些结果中，我们发现GO∶2001234、GO∶0051480、GO∶0051090与前列腺癌的发生发展相关，在24个共同靶蛋白基因中选择均富集在上述3个功能富集选项中的基因。如图4A所示，共有8个基因成为本研究中的关键基因(ADDRA1,BDKRB2,CDC42,CTNMB1,HAP1,HDAC2,NEDD4,SIRT1)。

图4 从关键基因中筛选研究靶点

2.3 关键基因在前列腺癌组织及正常组织之间表达量 在GEPIA数据库中获得了上述8个关键基因的表达量情况，见图4B。在这8个基因中，只有BDKRB2基因在前列腺肿瘤组织和正常组织之间表达差异具有统计学意义。因此，确定BDKRB2基因为本研究的治疗靶点。

2.4BDKRB2基因生存分析和tdROC曲线分析结果 在“2.3”项中，我们发现BDKRB2基因在前列腺癌组织中显著低表达，因此，为了明确该基因对患者预后生存的影响，我们对该基因进行了生存分析。如图5A所示，当BDKRB2基因表达量降低时，患者预后生存时间显著下降。Log-rank检验显示，P<0.05；cox单因素分析显示，P<0.05,HR=0.61。结果表明，BDKRB2基因对前列腺癌患者预后生存为保护因素。图5B显示了tdROC的结果，其中，3年、5年、7年曲线下面积分别为0.507、0.522、0.606。

2.5BDKRB2基因单基因GSEA分析结果 根据富集分数对结果进行降序排名，选择前10名结果。由图5可见，当BDKRB2基因表达量升高时，碱基切除修复以及错配修复两个通路激活。当BDKRB2基因表达量降低时，钙离子信号通路、细胞黏附分子CAMS、细胞因子-细胞因子受体相互作用、局部黏着、JAK_STAT信号通路、MAPK信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、癌症中信号通路被激活。当BDKRB2基因表达量升高时，患者体内激活的通路参与抑制肿瘤形成的过程BDKRB2基因表达量降低时，患者体内一些促进肿瘤形成的经典信号通路激活。

图5 对BDKRB2基因进行GSEA分析

3 讨论

本研究发现，月桂酸和姜黄二酮对肿瘤的治疗有显著的意义。通过化合物结构中的官能团比对，预测出两者共同的靶蛋白基因。本研究基于TCGA数据库前列腺癌患者的测序数据，确定了BDKRB2基因对前列腺癌患者预后生存为保护因素。当BDKRB2基因表达量升高时，人体内抑制肿瘤形成的相关通路激活；当BDKRB2基因表达量降低时，人体内促进肿瘤形成的相关通路激活。

本研究显示，BDKRB2基因在前列腺癌中通过碱基切除修复以及错配修复两个通路发挥抑癌作用。致癌物可导致DNA的损坏，这些损坏可被碱基切除修复信号通路修复，从而抑制肿瘤的形成[14]。当前列腺癌的错配修复基因发生突变时，疾病将呈现出侵袭性的临床病理特征[15]。同时，BDKRB2基因表达量降低时，体内一些促癌信号通路被激活，如钙离子信号通路、细胞黏附分子CAMS、细胞因子-细胞因子受体相互作用、局部黏着、JAK_STAT信号通路、MAPK信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、癌症中信号通路。钙离子信号通路通过促进细胞增殖及抑制细胞死亡来发挥其促癌作用[16]。细胞黏附分子CAMS对宫颈癌的发生发展具有促进作用[17]。有报道，细胞因子-细胞因子受体相互作用与肿瘤微环境相关，并可作为癌症治疗与监测的研究方向[18]。JAK_STAT信号通路促进肿瘤细胞的存活、增殖、侵袭及转移，是癌症药物治疗的有效靶点[19]。MAPK信号通路在胃贲门细胞癌中发挥促进肿瘤细胞增殖以及抑制肿瘤细胞凋亡的作用[20]。

综上所述，本研究首先基于月桂酸和姜黄二酮具有抗肿瘤性质，探索两者共同靶蛋白基因，然后发现BDKRB2基因作为月桂酸和姜黄二酮的共同靶点，是前列腺癌患者预后的保护因素。最后，通过GSEA分析，确定了BDKRB2基因在前列腺癌中相关的信号通路，为后续研究提供方向。综上所述，月桂酸和姜黄二酮可共同作用于BDKRB2基因，从而在前列腺癌中发挥治疗作用。但是本研究内容尚不够深入，需要在后续研究中进行功能学验证，以及信号通路验证。