非小细胞肺癌组织中NOTCH 1的表达情况及其与患者临床特征和EGFR基因突变状态的关系

庄其宏，陈岚兰，卢 芳，黄申晖

厦门大学附属第一医院呼吸科，福建 厦门361003

近年来，随着城市化和工业化的发展，人们生活水平提高的同时，多种疾病的发生率也在不断上升[1]。据统计，全球每年有100多万人死于肺癌[2]，肺癌主要包括小细胞肺癌（small cell lung cancer，SСLС）和非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSСLС），后者包括鳞状细胞癌、腺癌及大细胞癌。近年来，肺癌的治疗取得了长足进步，除传统治疗手段（手术、化疗、放疗）外，靶向治疗的兴起也为肺癌的临床治疗提供了一种新的方法。在各种类型的肺癌中，NSСLС最常见，占全部肺癌的80%～90%[3]。随着分子生物学技术的发展，人们对NSСLС的研究不仅仅停留在药物治疗上，在发病机制上也有了深层次的了解[4]。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因过表达或突变均会影响肿瘤细胞的发展。研究表明，EGFR基因是NSСLС靶向治疗中最重要的靶点之一，且EGFR-酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI）已成为治疗NSСLС的重要药物之一[5]。然而临床中发现，EGFR-TKI治疗数月后NSСLС患者会出现不同程度的耐药，因此目前关于其耐药机制的研究成为热点[6]。研究发现，notch受 体1（notch receptor 1，NOTСH1）基因 参 与NSСLС的发生和发展，同时NOTCH1基因也与靶向药物的耐药性有关[7]。本研究通过免疫组织化学染色法检测NSСLС组织中NOTСH1的表达情况及其与患者临床特征和EGFR基因突变状态的关系，旨在探讨EGFR-TKI的耐药机制，为NSСLС的靶向药物治疗提供新思路，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2017年3月至2018年2月于厦门大学附属第一医院接受手术治疗的67例NSСLС患者。纳入标准[8]：①均经术后病理学检查证实为NSСLС；②术前未进行中药治疗、生物治疗、放疗、化疗等。排除标准：肺部出现严重感染的患者。67例患者中，男43例，女24例；年龄为39～75岁，平均（54.18±12.19）岁；病理类型：鳞状细胞癌24例，腺癌43例；临床分期：Ⅰ～Ⅱ期48例，Ⅲ～Ⅳ期19例；分化程度：高/中分化45例，低分化22例；淋巴结转移41例，无淋巴结转移26例。所有患者均进行EGFR基因检测，根据EGFR基因突变状态的不同将患者分为3组，其中野生组患者29例，突变组（18、19、21外显子突变）患者20例，耐药组（20外显子T790M点突变）患者18例。3组患者的病理类型、临床分期、分化程度及淋巴结转移情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）（表1），具有可比性。本研究经医院伦理委员会审批通过，所有患者均对本研究知情并签署知情同意书。

1.2 主要仪器与试剂

Leica Bond-max全自动免疫组化染色机、RM2235切片机、Bond聚合物精细检测系统、脱蜡液均购自德国Leica公司，兔抗人NOTСH1多克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 免疫组织化学染色方法

采用免疫组织化学两步法检测NSСLС组织中NOTСH1的表达情况，首先对石蜡标本行4 μm连续切片，保证切片完整无空洞、平整无褶皱，无气泡，常规脱蜡入水。滴加3%H2O2，室温下孵育10 min，灭活内源性过氧化物酶的活性。热抗原修复后，室温下自然冷却，加入一抗，4℃下放置过夜；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗 3次，每次2 min，加入NOTСH1抗体，于37℃恒温箱内孵育20 min；PBS冲洗3次，每次2 min，加入1∶500稀释的山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗，稀释液使用3%脱脂牛奶，于37℃恒温箱内孵育30 min；再用PBS冲洗3次，每次2 min，然后采用二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色剂进行显色，蒸馏水冲洗，苏木素衬染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。以PBS代替一抗作为阴性对照，以已知NOTСH1阳性表达的石蜡切片作为阳性对照[9]。

表 1 3组患者的基线特征[ n（%）]

1.4 免疫组织化学染色结果判定

由3名及以上病理医师采用双盲法进行阅片。NOTСH1阳性表达定位于细胞膜和（或）细胞质，呈棕黄色或黄色颗粒。200倍显微镜下随机选取5个视野，每个视野计数200个细胞。阳性细胞所占百分比评分：＜5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。染色强度评分：无色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞所占百分比评分与染色强度评分相加，0～1分为阴性，2～3分为阳性[10]。

1.5 统计学分析

采用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析。计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；多因素分析采用Logistic回归分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC患者中NOTCH 1表达情况影响因素的单因素分析

临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、分化程度为低分化、有淋巴结转移的NSСLС患者的NOTСH1阳性表达率均高于临床分期为Ⅰ～Ⅱ期、分化程度为高/中分化、无淋巴结转移的患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。不同病理类型的NSСLС患者的NOTСH1阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表2）

表 2 NSСLС患者中NOTСH 1表达情况影响因素的单因素分析（n=67）

2.2 NSCLC患者中NOTCH 1表达情况影响因素的多因素分析

将单因素分析中差异有统计学意义的变量纳入多因素Logistic回归分析，结果显示，临床分期、分化程度和淋巴结转移情况均是NSСLС患者NOTСH1表达情况的独立影响因素（P＜0.05）。（表3）

表 3 NSСLС患者中NOTСH 1表达情况影响因素的多因素分析（n=67）

2.3 3组患者中NOTCH 1阳性表达率的比较

野生组、突变组、耐药组患者的NOTСH1阳性表达率分别为51.7%（15/29）、40.0%（8/20）、83.3%（15/18），3组比较，差异有统计学意义（χ2=7.766，P＜0.05）。其中，耐药组患者的NOTСH1阳性表达率高于野生组和突变组患者，差异均有统计学意义（χ2=4.806、7.446，P＜0.05）。

3 讨论

NSСLС是一种常见的恶性肿瘤，随着近年来环境的不断恶化，NSСLС的发病率逐年增长[11]。因此，研究NSСLС的治疗方法意义重大。目前晚期NSСLС的常用治疗方法是以EGFR为靶点的药物治疗，然而患者易产生原发性耐药及获得性耐药，因此，探讨EGFR-TKI的耐药机制已成为医学研究的热点[12]。研究发现，NOTСH1与NSСLС靶向药物的耐药有关。NOTСH1是NOTСH信号通路中的关键受体之一，越来越多的证据表明NOTСH1参与肿瘤细胞的生长、增殖、凋亡、转移及化学抗性的调节[13]。Lamb等[14]研究发现，60%～70%的EGFR-TKI获得性耐药与EGFR基因20外显子T790M突变密切相关。相关研究显示，在EGFRTKI获得性耐药的肺癌细胞中，NOTСH1的表达水平上调，更重要的是，NOTСH1促进了上皮-间充质转化表型的获得，这与EGFR-TKI的获得性耐药密切相关[15]。然而，目前有关不同EGFR突变状态的NSСLС患者中NOTСH1的表达情况及临床意义尚未完全明确，本研究通过检测NSСLС组织中NOTСH1的表达情况，分析NOTСH1表达情况与EGFR基因突变状态的关系，以期为NSСLС耐药机制的研究提供新思路。在耐药组中，EGFR基因20外显子T790M突变频率增加，EGFR基因突变可能导致NOTСH信号通路激活，进而导致NOTСH1表达水平上调。

本研究采用免疫组织化学染色法检测67例NSСLС组织中NOTСH1的表达情况，结果显示，临床分期为Ⅰ～Ⅱ期、分化程度为高/中分化、无淋巴结转移的NSСLС患者的NOTСH1阳性表达率均低于临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、分化程度为低分化、有淋巴结转移的患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。不同病理类型的NSСLС患者的NOTСH1阳性表达率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。进一步的Logistic回归分析结果显示，临床分期、分化程度和淋巴结转移情况均是NSСLС患者中NOTСH1表达情况的独立影响因素（P＜0.05）。

根据EGFR基因突变状态的不同，本研究将NSСLС患者分为3组，即野生组、突变组（18、19、21外显子突变）及耐药组（20外显子T790M点突变），并分析不同组别患者的NOTСH1表达情况，结果显示，耐药组患者的NOTСH1阳性表达率为83.3%，高于野生组患者的51.7%和突变组患者的40.0%，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

综上所述，临床分期、分化程度和淋巴结转移情况均是NSСLС患者中NOTСH1表达情况的独立影响因素。EGFR-TKI获得性耐药的NSСLС中NOTСH1的阳性表达率较高，NOTСH1高表达可能是EGFR-TKI耐药的重要原因。本研究仅对NOTСH1靶点进行分析，随着对EGFR-TKI耐药机制研究的不断深入，相信越来越多的与EGFR-TKI治疗相关的分子标志物及其相互关系也会被发现。