涎腺恶性肿瘤中血管生成拟态的表达及临床意义△

高琼，冯红超，唐正龙，马洪，段晓峰，毛本源#

1贵州医科大学附属口腔医院口腔颌面外科，贵阳550004

2贵阳市口腔医院口腔颌面外科，贵阳5500060

涎腺恶性肿瘤多为涎腺上皮组织来源的恶性肿瘤，可发生于大涎腺如腮腺、颌下腺和舌下腺，也可发生于小涎腺如腭腺等，具有组织分型多、细胞成分复杂等特点[1]。血液供应是包括涎腺恶性肿瘤在内的各种实体瘤生长的必要条件，肿瘤内血管系统的建立可以通过多种方式进行，肿瘤细胞的生长和转移均依赖于肿瘤内新血管的生成。Maniotis等[2]于1999年在研究人眼侵袭性葡萄膜黑色素瘤微循环时发现一种与经典的血管生成途径不同的血管生成模式——血管生成拟态（vasculogenic mimicry，VM）。肿瘤细胞可以通过VM管道结构获得宿主的血液供应，从而为肿瘤组织的进行性生长、浸润和转移提供足够的血液供应[3-4]。VM是指由高度恶性肿瘤细胞形成的无内皮细胞参与的、由细胞外基质界限的具有输送血液功能的管腔结构，因此，存在VM结构的恶性肿瘤常具有高度恶性、高转移性、高侵袭性的特点[5]。在临床上，涎腺恶性肿瘤的发病率虽然较低，但是其恶性程度及转移率均高，易复发，预后较差[6]。随着治疗手段的不断深入更新，目前手术切除是治疗涎腺恶性肿瘤的最常用手段，但是尽管行根治性手术切除，涎腺恶性肿瘤患者的5年生存率仍仅约为40%，严重威胁着患者的生命健康[7]。因此，研究涎腺恶性肿瘤中有无VM形成，有利于明确肿瘤浸润和转移的机制，对于涎腺恶性肿瘤的治疗有重大意义。基于此，本研究通过对人涎腺恶性肿瘤石蜡标本进行常规组织学检查及免疫组化结合的双重染色，初步研究涎腺恶性肿瘤中是否存在VW结构，观察不同类型涎腺恶性肿瘤与VM结构的形成有无联系，探讨腺样囊性癌的生物学特征与VM的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2003—2011年贵州医科大学附属口腔医院保存的经手术切除、福尔马林固定、常规石蜡包埋的，并经过病理证实的涎腺恶性肿瘤患者的涎腺恶性肿瘤组织标本43例；同时，选取贵州医科大学附属口腔医院同期保存的因外伤而行常规手术切除患者的正常涎腺组织标本5例为对照。43例涎腺恶性肿瘤患者中，男23例，女20例；5例外伤患者中，男2例，女3例。

1.2 主要试剂与仪器

Mouse anti-СD31鼠抗人СD31单克隆抗体、浓缩型DAB显色试剂盒、PV-9000二步法免疫组化检测系统均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 检测方法

将获取的所有组织标本蜡块进行连续切片，厚度约为4 μm，将石蜡切片放置于防脱载玻片后，再放置于60℃的烤箱中固定6小时，装盒备用。分别进行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色复查诊断、组织分型及СD31+PAS双重染色。先将涎腺恶性肿瘤切片按照常规进行HE染色，光镜下观察结果，复查病理诊断。将组织切片用二甲苯各浸泡10 min；之后采用梯度乙醇进行水化。最后用PBS冲洗以去除切片上残留的乙醇，每次大约5 min。取适量柠檬酸缓冲溶液（pH=6.0）于热修复专用切片盒中，放入高压锅中加热至沸腾，将切片置于缓冲液中，继续加热至喷漆后3 min。室温下冷却，蒸馏水洗。后滴加3%的H2O2，烤箱中37℃孵育20 min。之后采用PBS反复冲洗。每张标本切片滴加1滴一抗（anti-СD31），置于4℃冰箱孵育过夜；滴加二抗，次日取出标本切片，恢复至室温，反复冲洗。每张标本切片滴加1滴试剂A（聚合物增强剂），孵育20 min，之后用PBS冲洗。擦干后每张标本切片滴加试剂B[辣根过氧化物酶标记的羊抗兔/小鼠免疫球蛋白 G（immunoglobulin G，IgG）聚合物]，37℃孵育30 min，之后用PBS液冲洗3次。二氨基联苯胺显色7 min，待血管内皮细胞着色后，自来水冲洗4 min，终止显色反应。将标本切片置于0.5%的过碘酸溶液中还原后再置于Schiff液中，反应约15 min。取出标本切片，用蒸馏水反复冲洗3次，每次1 min，之后再流水冲洗3～5 min。苏木精衬染细胞核1 min，自来水冲洗2 min。盐酸酒精分化，自来水返蓝。常规乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。进行观察。

1.4 判定标准

VM判断标准：内皮细胞是血管壁的重要组成部分，СD31是重要的内皮标志物，СD31阳性结果为主要位于细胞膜上呈棕黄色颗粒着色。本实验为区别内皮依赖性血管，选择СD31作为鉴别分子。同时肿瘤细胞基底膜经PAS染色后相应部位呈淡粉色或樱桃红着色。参考Maniotis等[2]方法，在光镜下观察，病理切片中观察到СD31标记的内皮性血管，其PAS染色也为阳性。以及СD31染色为阴性，由肿瘤细胞构成管壁的管腔样结构。

微血管密度（microvessel density，MVD）：参考Weidner校正方法[8]，先在光学显微镜低倍镜下寻找血管密集的热点（hot spot）区域，然后计数3～5个高倍视野内的微血管，取其平均数即为该肿瘤的MVD。

1.5 统计学分析

采用SPSS 18.0统计软件对数据进行分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 涎腺恶性肿瘤CD31和PAS双重染色结果分析

PAS染色结果显示，浆液腺泡，呈红色（图1A）；黏液腺泡，为无色；浆黏液腺泡，呈浅红色（图1B）。43例涎腺恶性肿瘤组织的СD31和PAS双重染色结果显示，显微镜下观察发现，典型的管道样拟态结构由肿瘤细胞构成，管壁无内皮细胞，管腔内有红细胞存在，很少见坏死的肿瘤细胞及炎细胞。说明VM是由肿瘤细胞拟血管生成的一种具有血管功能的血管通路。因此VM结构在显微镜下表现为由肿瘤细胞围成的管道样结构，内有红细胞。构成管腔的肿瘤细胞及肿瘤细胞与红细胞之间均无СD31染色阳性物质存在，表明无内皮细胞参与此管道的构建。在红细胞和肿瘤细胞之间有PAS阳性物质间隔，也有部分管腔中有PAS染色阳性物质填充。在涎腺恶性肿瘤中也发现了PAS阳性网络结构，此结构成条索状，内无管腔，可见部分条索结构与内皮依赖性血管相接，而内皮性血管在显微镜下可见СD31染色阳性的内皮围成管腔样或网状结构，有时内皮可见PAS染色阳性的基质（图2）。5例正常腺体组织的СD31和PAS双重染色结果显示，未发现VM结构（图3）。

图3 СD31和PAS在正常口腔腺体组织中的表达情况（PV法，×400）

2.2 涎腺恶性肿瘤组织和正常口腔腺体组织中VM情况

43例涎腺恶性肿瘤中，腺样囊性癌33例，黏液表皮样癌4例，多形性腺瘤3例，腺泡细胞癌2例，肌上皮癌1例。СD31和PAS双重染色结果显示，43例涎腺恶性肿瘤的VM阳性率为18.6%（8/43），其中5例腺样囊性癌VM阳性，1例黏液表皮样癌VM阳性，1例多形性腺瘤VM阳性，1例肌上皮癌VM阳性。5例正常腺体组织的VM阳性率为0%（0/5）。两种组织标本的VM阳性率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 涎腺恶性肿瘤中血管生成与拟血管生成的相关性分析

多变量相关分析结果显示，涎腺恶性肿瘤组织中VM的数量与血管数量呈正相关（r=0.548，P＜0.01）。

2.4 腺样囊性癌中VM与病理分型的关系

33例腺样囊性癌中，实质型12例，腺样-管状型21例（管状型10例，腺样型11例）；其中腺样-管状型腺样囊性癌组织中VM阳性率为4.8%（1/21），实质型腺样囊性癌组织中VM阳性率为33.3%（4/12），实质型腺样囊性癌组织中VM阳性率高于腺样-管状型腺样囊性癌组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.5 腺样囊性癌中VM与MVD的关系

33例腺样囊性癌标本中，5例VM阳性，28例VM阴性；VM阳性腺样囊性癌中MVD为（35.09±14.40），高于VM阴性腺样囊性癌的（24.63±20.63），但差异无统计学意义（t=1.081，P＞0.05）。

3 讨论

血管生成拟态是指由具有可塑性、侵袭性的肿瘤细胞构成的，而无内皮细胞参与条件下细胞外基质界限的管腔结构。肿瘤生长相关理论提出肿瘤的生长与转移依赖于新血管的形成，从而使肿瘤获得丰富的营养物质和氧，减少其中心坏死的出现，更利于肿瘤的生长。由于VM无内皮细胞衬里，存在一层PAS阳性基底膜结构，肿瘤细胞可与血液直接接触，因此肿瘤细胞可获得更丰富的营养和氧[9]。由于VM结构缺少内皮屏障，构成VM管壁结构的肿瘤细胞脱落后可直接进入血流，为肿瘤的远处转移提供了有利条件。大量研究表明，VM仅存在于一些高侵袭性的恶性肿瘤中，如肾透明细胞癌、乳腺导管癌等[10-11]。因此VM存在与否与肿瘤的转移及预后密切相关。

本研究通过СD31+PAS双重染色对涎腺恶性肿瘤组织进行染色，结果发现涎腺恶性肿瘤组织中存在VM结构，而正常腺体组织中无VM结构。光镜下对VM结构进行观察，发现VM结构是由肿瘤细胞构成的非内皮细胞衬附的管道或网状结构。在VM管腔中，PAS阳性物质将肿瘤细胞与管腔中的血流分隔开，部分标本中可见PAS阳性物质填充部分管腔；本研究还发现，在涎腺恶性肿瘤中存在PAS阳性网络结构，该结构呈条索状，内无管腔，可见部分条索结构可与内皮依赖性血管相接。本研究结果与Maniotis等[2]研究发现的典型的拟血管结构是由肿瘤细胞构成，管壁无内皮细胞，管腔内有红细胞存在相符合。构成管腔的肿瘤细胞间及肿瘤细胞与红细胞间均无СD31染色阳性物质存在，表明无内皮细胞参与此管道的构建。在红细胞和肿瘤细胞之间有PAS阳性物质间隔，也有部分管腔中有PAS染色阳性物质填充。VM是由肿瘤细胞拟血管生成的一种具有血管功能的血管通路。本研究结果显示，43例涎腺恶性肿瘤组织中，有部分VM结构可与内皮性血管相连，肿瘤组织通过VM与宿主血管相连通，从而为肿瘤组织的生长、浸润和转移提供足够的血液供应；涎腺恶性肿瘤组织与正常腺体组织中VM的阳性率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；本研究还对涎腺恶性肿瘤血管与VM数量之间关联性进行分析，结果显示涎腺恶性肿瘤组织中VM的数量与血管数量呈正相关（P＜0.01）。

腺样囊性癌是涎腺恶性肿瘤中最常见的一种恶性肿瘤，是一种侵袭性很强的肿瘤，通过黏膜下及纤维组织向肿瘤周围播散，同时有沿神经扩散[12-13]。涎腺腺样囊性癌远处转移率较高，常见的转移部位为肺[14-15]。本研究根据病理类型不同，对33例涎腺腺样囊性癌组织中VM的阳性情况进行分析，结果显示实质型腺样囊性癌组织中VM阳性率高于腺样-管状型腺样囊性癌组织，差异有统计学意义（P＜0.05），提示涎腺恶性肿瘤的恶性程度越高或侵袭行为越强的病理分型VM阳性率越高，侵袭行为越强或恶性程度越高的恶性肿瘤细胞本身基因表型越复杂，肿瘤细胞的可塑性越强，同时肿瘤生长速度越快，均可导致肿瘤局部缺氧压力越高，越促进VM的形成。

Folberg等[16]研究发现，PAS染色阳性物质图案状分布的特点与葡萄膜黑色素瘤的预后密切相关。Fan等[17]研究发现，原发性胆囊癌的预后更差，VM生成是原发性胆囊癌患者的独立预后因素之一。目前组织活检病理学检查等技术可以用于发现有无VM形成[18]。若术前能够充分了解肿瘤供血系统的结构，便可以对肿瘤的具体情况做出更准确地评估，从而选择更为适合的治疗方式，对于手术范围的确定可更为合理。减少了手术中由于手术范围过小肿瘤术后短期复发、转移或手术范围过大影响患者术后的生存质量。VM具有一定的可塑性，在光镜下形成VM管壁的肿瘤细胞与内皮性血管的内皮细胞相似，采用一般的组织病理学方法难以将两者区分开，为了更有效地提高VM的检出率，采用СD31+PAS双重染色来检测VM，并证明该方法是可行的、经济的。VM的检测对于判断涎腺恶性肿瘤的预后具有一定的意义。然而肿瘤的血液供应途径相当复杂，因此临床上如果能结合不同血管的表达情况对涎腺恶性肿瘤的预后进行评估则会更为准确。如何更有效的、定量并综合分析VM与涎腺恶性肿瘤侵袭、转移、预后之间的相关性，还需要进一步深入研究。

综上所述，涎腺恶性肿瘤中VM的存在对患者的预后提出了巨大的挑战，为抗血管治疗提供了新的靶点。