山楂饮片对胰脂肪酶活性的抑制作用研究

李强，徐天任，吕畅，戴衍朋

(1.东营市食品药品检验中心，山东东营257091；2.山东中医药大学，山东 济南250355；3.山东大学，山东 济南250012；4.山东省中医药研究院，山东 济南 250014)

肥胖症是一种较为多见的脂质代谢紊乱综合征，它不仅是单纯的体重增加，而且与糖尿病、高血压、血脂异常、癌症等慢性病有密切关系[1-2]。随着大众生活水平的逐渐提高以及生活方式的改变，肥胖症的发病率逐年上升，公众对其关注度也越来越高。因此，如何预防和治疗肥胖症成为当下比较热门的研究方向。目前，市面上广泛使用的减肥药为奥利司他(Orlistat)，这是一种长效的、强效的特异性胃肠道脂肪酶抑制剂，能有效抑制胰脂肪酶(PL)的活性，失活的酶不能将食物中的脂肪(多为甘油三酯)水解为可吸收的甘油单酯及游离脂肪酸，从而起到降糖降脂、减轻体重的目的，改善与肥胖有关的状态[3]。然而有相关研究表明，奥利司他可能导致严重的肝损害、肾损害，也会引起患者胃肠不良反应，长期使用可致营养不良[4]。因此，从天然药物中找寻奥利司他的替代品是当前研究的主要目的。

近年来，从天然动植物资源中获取有显著活性且毒性较低的多糖用于日常保健治疗已成为国内外生物大分子领域的研究热点[5]。山楂为蔷薇科植物山里红(Cralaegus pinnatifida.Bge.var.major N.E.Br.)或山楂(Crataegus pinnatifida Bge.)的干燥成熟果实[6]，自古药食两用，有消食化积，健脾开胃的功效[7]。山楂的药用价值很高，不仅可以调节动物体内脂代谢，还可以保护心血管系统、抗氧化、抗肿瘤等[8]。本试验以山楂为研究对象，旨在探究山楂饮片的水提液在体外对胰脂肪酶活性的抑制作用，为新的具有抗肥胖作用的药品、保健品开发提供数据支撑。

1 材料与仪器

1.1 仪器 Multiskan FC酶标仪(Thermo Scientitic公司)；TGL-16B高速离心机(上海安亭科学仪器厂)；PHS-3E pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)；涡旋混匀器(广州艾卡仪器设备有限公司)；DK-S22电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)；96孔板(NEST生物科技有限公司)；移液枪(Eppendorf公司)。

1.2 试剂 山楂(市售样品24批、自制样品34批)；对硝基苯基丁酸酯(pNPB，上海甄准生物科技有限公司)；胰脂肪酶(Pancreatic Lipase，PL，合肥博美生物科技有限公司)；奥利司他(Orlistat，上海源叶生物科技有限公司)；磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O，国药集团)；磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O，天津鼎盛鑫化工有限公司)；三羟甲基氨基甲烷(Tris，合肥博美生物科技有限公司)；二甲基亚砜(DMSO，天津富宇精细化工有限公司)；乙腈(Acetonitrile，西陇化工股份有限公司)，试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 山楂饮片提取液制备 取不同山楂饮片约5.0 g，加50 mL水，加热回流，沸腾后开始计时，保持微沸，提取30 min，滤过，药渣加水50 mL，煎煮 30 min，滤过，弃去药渣，合并滤液，浓缩至50 mL，得到生药质量浓度为100 mg·mL-1的水提液。

2.1.2 山楂样品制备 水提液12 000 rpm离心10 min，用 Tris-HCl缓冲液稀释到质量浓度为 50 mg·mL-1，再用DMSO逐级稀释，得到质量浓度为10 mg·mL-1的样品。

2.1.3 PBS缓冲液制备 准确称取17.9 g Na2HPO4·12H2O和7.80 g NaH2PO4·2H2O，加入蒸馏水溶解，定容到250 mL，4℃保存备用。使用时，在pH计标定下，逐渐向Na2HPO4溶液中加入NaH2PO4溶液，最后得浓度为200 mmol·L-1，pH＝7.5的 PBS缓冲液。

2.1.4 Tris-HCl缓冲液制备 准确称取1.50 g Tris，2.92 g NaCl加入蒸馏水溶解，定容至250 mL，用HCl调节 pH 为7.5，得浓度为50 mmol·L-1的Tris-HCl缓冲液，于4℃保存。

2.1.5 胰脂肪酶溶液(PL)制备 精密称取适量胰脂肪酶粉末，用PBS缓冲液配制成质量浓度为 1 mg·L-1的粗酶液，4 000 rpm离心5 min，取上清液，现配现用。

2.1.6 pNPB溶液(底物)配制 用移液枪吸取18 μL pNPB溶液于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，得浓度为10 mmol·L-1的溶液，置于4℃保存备用。

2.1.7 奥利司他溶液配制 精密称取奥利司他标准品粉末0.123 9 g于25 mL容量瓶中，用DMSO定容得1 mmol·L-1的溶液，采用2倍稀释法用Tris-HCl缓冲液逐级稀释至10μmol·L-1，置于4℃保存备用。

2.2 试验方法与结果

2.2.1 最适底物浓度筛选 用乙腈配制不同浓度的对硝基苯酚丁酯底物溶液(pNPB)，取pH 7.5的Tris-HCl缓冲液800μL，酶溶液100μL，于37℃下孵育10 min后，加入配制好的不同浓度的pNPB溶液100μL，于 37℃下反应10 min后，405 nm测定吸光度值，以不添加酶作为其空白对照组，计算酶活，分析底物浓度对酶活力的影响。

由酶底物线性图可知，底物浓度在 10 mmol·L-1以下时酶活随着底物浓度的增加活力上升明显，在10 mmol·L-1出现拐点之后活力基本没有变化。因此选取10 mmol·L-1作为胰脂肪酶抑制率试验底物浓度，结果见图1。

2.2.2 酶最适pH筛选 分别配制不同pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)的 Tris-HCl缓冲液。 取不同pH 的Tris-HCl缓冲液 800μL，酶溶液100μL，于37℃水浴锅中孵育10 min后，加入配制好的10 mmol·L-1(pNPB)溶液 100μL，37℃下反应10 min后，405 nm测定吸光度值，以不添加酶作为其空白对照组，计算酶活，分析不同pH对酶活力的影响。

酶活力随着pH的增高呈现出先升高后降低的趋势，为典型的钟罩型曲线变化，其结果也与大多数文献报道的采用对硝基苯酚酯底物法的最适pH 7.5相同。说明胰脂肪酶在偏碱性的条件下活力较强。因此试验过程中配制pH 7.5的Tris-HCl缓冲液，结果见图2。

2.2.3 酶最适温度筛选 取pH 7.5的Tris-HCl缓冲液 800 μL，酶溶液100 μL，分别于 25、30、37、40、45℃下孵育10 min后，加入配制好的10 mmol·L-1(pNPB)溶液100μL，再分别于各孵育温度下反应10 min后，405 nm测定吸光度值，以不添加酶作为其空白对照组，计算酶活，分析不同温度对酶活力的影响。

酶活力随着温度的升高呈现出先升高后降低的趋势，胰脂肪酶最适温度在37℃。国际上通用的测定酶活的温度为30℃和37℃，而30℃的温度较低，反应速度较慢，其测定的灵敏度也较为迟缓。因此结合本试验结果，选取37℃作为酶反应温度，结果见图3。

2.2.4 胰脂肪酶抑制率测定方法 在1.5 mL的EP管中加入抑制剂(或Tris-HCl)与酶于37℃下孵育10 min，加入150μL底物，混匀，孵育5 min。取150 μL于96孔板中，于405 nm下测定吸光度。

胰脂肪酶抑制率计算公式为：抑制率(%)＝[1-(B-b)/(A-a)]×100[9-10]，其中，A 为未添加抑制剂酶的活性，a是其空白对照(未加酶)；B是加入抑制剂的酶的活性，b是其阴性对照(未加酶)。

每个试验重复3次，最终求得所得结果的平均值。各组加入量如表1所示。

表1 反应体系各组所加试剂及用量

2.2.5 奥利司他胰脂肪酶抑制率测定 精密称取适量的奥利司他(阳性药物)加入DMSO溶解后，用配制好的 Tris-HCl稀释成 0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0μmol·L-1不同浓度的奥利司他溶液作为胰脂肪酶抑制剂，按照胰脂肪酶抑制率测定方法测定奥利司他对胰脂肪酶的抑制率，运用Graphpad Prism 7.0软件以抑制剂不同浓度的对数为X轴，以对胰脂肪酶的抑制率为Y轴进行线性分析，从而计算得其IC50(见图4)。

不同浓度的奥利司他的抑制率如表2所示，计算得奥利司他 IC50为0.516 1 mg·mL-1。

表2 不同浓度奥利司他抑制率

2.2.6 山楂样品胰脂肪酶抑制率测定 取14号山楂样品的供试品液以12 000 rpm离心10 min，用Tris-HCl缓冲液稀释到50 mg·mL-1，再用 DMSO逐级稀释到 25、20、10、5、2 mg·mL-1作为胰脂肪酶抑制剂，按照胰脂肪酶抑制率测定方法测定山楂样品对胰脂肪酶的抑制率，运用Graphpad Prism 7.0软件以抑制剂不同浓度的对数为X轴，以对胰脂肪酶的抑制率为Y轴进行线性分析，从而计算得其IC50。

不同浓度的山楂水提液样品的抑制率如表3所示，计算得山楂水提液样品的IC50为13.40 mg·mL-1。

表3 不同浓度山楂饮片抑制率

以质量浓度为10 mg·mL-1的山楂水提液样品作为胰脂肪酶抑制剂，测得各样品抑制率如表4所示。

由表4可知，不同产地、不同批次山楂均具有一定胰脂肪酶抑制活性，24批山楂对胰脂肪酶的抑制率均值为38.69%±7.79%，中值为39.57%，抑制率在26.08%～49.73%之间。16批山东青州产的山楂样品中，抑制率均值为 40.48%±7.82%，中值为42.61%，抑制率在26.08%～49.73%之间。

3 讨论与总结

胰脂肪酶由胰腺分泌，是食物脂肪水解过程中的主要酶类，负责代谢 50%～70% 的甘油三酯，抑制其活性可有效抑制脂肪的水解和吸收，以达到控制和治疗肥胖的目的[11-13]。奥利司他(Orlistat)是一种专一强效的胃肠道胰脂肪酶抑制剂，其主要通过抑制胰脂肪酶的活性，减少人体内脂肪的吸收，改善胰岛素抵抗，从而发挥减重效果[14-15]。本试验以奥利司他标准品作为阳性药物，旨在考察以对硝基苯基丁酸酯作为底物的抑制率测定方法是否合理，是否真实可行。结果表明，奥利司他对胰脂肪酶的活性有显著的抑制作用。

表4 市售山楂饮片胰脂肪酶抑制率(n＝3)

在所收集的不同产地不同批次山楂样品中，产地为山东青州的共有16批，结果表明，同一产地的山楂其抑制活性也有较大差异；青州产地的平均抑制率为40.5%，而其他产地抑制率平均为35.1%。

青州产地的山楂样品中，2016年批次的平均抑制率为(48.3%±2.2%)，2017年批次的平均抑制率为(45.3%±3.2%)，2018年批次的平均抑制率为(35.6%±8.1%)，2019年批次的平均抑制率为(41.3%±4.6%)，由此可知，山楂对胰脂肪酶的抑制率并未随贮存时间的延长而降低，表明山楂中对胰脂肪酶具有抑制作用的成分可能具有较高的稳定性。

青州产地的一级品、二级品、三级品山楂，对胰脂肪酶的抑制率分别为46.37%、40.15%、37.31%，表明山楂对胰脂肪酶的抑制作用与其饮片的等级具有正相关关系，提示该指标可作为山楂饮片划分的生物效应指标。

不同批次、不同产地的山楂样品，抗胰脂肪酶的活性具有显著差异，在进一步的研究中，应进一步深入研究其中的主要活性部位或成分，为山楂的综合利用以及新的抗肥胖药物的研究提供数据支撑。