UPLC同时测定清热止咳颗粒中7种黄酮类成分含量

李鸷，余淑美，余代鑫，于娟，袁慧君，林少华，徐伟*

(1.福建中医药大学药学院，福建福州350122；2.漳州片仔癀药业股份有限公司，福建漳州363000)

清热止咳颗粒由黄芩、陈皮、枳壳、知母、浙贝母、重楼、桔梗等14味中药组成，具有清热化痰、宣肺止咳的功效，用于痰热阻肺所致的咳嗽，痰黏稠或黄，发热，急性支气管炎、慢性支气管炎(单纯型)急性发作的证候[1]。处方黄芩中的黄芩苷具有抗炎[2]、抗流感病毒[3]等作用，陈皮中的指标性成分橙皮苷有抗病毒[4]的作用，枳壳中的活性成分柚皮苷和新橙皮苷具有抗炎、抗氧化[5-6]等药效，黄酮类成分被认为是清热止咳颗粒主要药效成分之一。但目前清热止咳颗粒的质量控制仅以薄层鉴别和黄芩苷单一成分的含量测定为主[7]，检测指标单一，对于14味药的大复方质量控制不够全面。因此建立能同时测定其中多种指标成分的方法，对于其质量控制和确保疗效具有重要的意义。

近年来，超高效液相色谱(UPLC)法广泛运用于中药及其复方分析研究中[8-10]，具有高分析效率、高灵敏度的优点，可显著减少分析时间，同时会减少色谱溶剂的消耗。经查阅国内外文献，鲜有见UPLC法定量评价清热止咳颗粒的报道，故本试验建立UPLC法同时测定清热止咳颗粒中芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷7个指标性成分的含量，为复方清热止咳颗粒的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1290型超高效液相色谱仪(美国 Agilent公司)；CPA225D型十万分之一分析天平(德国Sartorius公司)；KQ-500E台式超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

对照品柚皮苷(批号：110722-201714)、橙皮苷(批号：110721-201617)、新橙皮苷(批号：111857-201703)、黄芩苷(批号：110715-201720)、汉黄芩苷(批号：112002-201702)，均购自中国食品药品检定研究院；芸香柚皮苷(批号：MUST-18030408，成都曼思特生物科技有限公司)；木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷(批号：14080123，上海同田生物技术股份有限公司)。清热止咳颗粒(福建漳州片仔癀药业股份有限公司，批号为 1804001、1804002、1804003、1804004、1804005、1804006、1709024)。 甲醇、乙腈、水均为色谱纯(上海安谱实验科技股份有限公司)，甲酸为色谱纯(上海阿拉丁试剂有限公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7μm)，流动相乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～2 min，15%～20%A；2～5 min，20%～21%A；5～8 min，21%～25%A；8～12 min，25%～30%A；12～15 min，30%～70%A；15～15.1 min，70%～15%A；15.1～18 min，15%～15%A)，柱温30℃，流速0.3 mL·min-1，进样量5 μL，检测波长280 nm。在此色谱条件下7个对照品与其他色谱峰的分离度均大于1.5，理论板数均大于5 000，色谱峰对称性良好。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 精密取芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和汉黄芩苷对照品适量，精密称定，加入甲醇超声溶解，制成质量浓度分别为0.648、1.070、0.552、1.078、1.108、0.660 和 0.484 mg·mL-1的单一对照品储备液，备用。分别精密量取上述对照品溶液适量，置同一容量瓶中，加入50%甲醇至刻度，即得芸香柚皮苷 6.480μg·mL-1、柚皮苷26.75 μg·mL-1、橙皮苷 13.80 μg·mL-1、新橙皮苷26.95 μg·mL-1、黄芩苷 55.40 μg·mL-1、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷6.600μg·mL-1和汉黄芩苷4.840μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取清热止咳颗粒，研细，精密称取0.1 g，置具塞三角瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理30 min(功率250 W，频率50 kHz)，放冷，再次称重，70%甲醇补足减失重，摇匀，0.22μm滤膜滤过，取续滤液，得供试品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 按照清热止咳颗粒处方工艺分别制备缺陈皮、缺枳壳、缺黄芩和同时缺陈皮和枳壳的阴性样品，按供试品溶液制备方法，同法制备相应的阴性样品溶液。

2.2.4 专属性考察 分别取供试品溶液、对照品溶液及4种阴性样品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行色谱分析，结果供试品溶液色谱中，与对照品相同保留时间处阴性样品溶液无干扰，其中芸香柚皮苷、橙皮苷来源于陈皮和枳壳，柚皮苷、新橙皮苷来源于枳壳，黄芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和汉黄芩苷来源于黄芩，UPLC色谱图见图1。

2.3 线性范围考察 取芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和汉黄芩苷的混合对照品溶液，用50%甲醇稀释配制为不同梯度浓度的混合对照品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进行测定。以芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和汉黄芩苷质量浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，分别绘制标准曲线，得回归方程和线性相关系数r，结果见表1。

表1 清热止咳颗粒中7个分析物的线性范围考察

2.4 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液5μL，1 d内连续进样6次，计算芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和汉黄芩苷峰面积的RSD分别为0.34%、0.19%、0.27%、0.25%、0.18%、0.29%、0.47%，结果表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验 取批号为1804005的清热止咳颗粒，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12 和 24 h 按“2.1”项下测定芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和汉黄芩苷的峰面积，结果RSD分别为0.22%、0.08%、0.18%、0.19%、0.22%、0.27%、0.33%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.6 重复性试验 精密称取同一批清热止咳颗粒(批号：1804005)6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下测定各成分的峰面积，带入标准曲线计算芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和汉黄芩苷峰的平均质量分数分别为0.05%、0.18%、0.12%、0.17%、0.67%、0.06%、0.06%，RSD 分别为 1.45%、1.84%、1.77%、1.16%、1.68%、1.24%、1.55%，结果表明方法重复性良好。

2.7 回收率试验 取重复性试验同批次清热止咳颗粒约0.05 g，精密称定，平行6份，每份分别精密加入近似等量的7种对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下测定各成分的峰面积，计算各个化合物的回收率和回收率的RSD结果见表2，结果表明该方法回收率良好。

2.8 样品含量测定 取批号为1804001、1804002、1804003、1804004、1804005、1804006、1709024 的清热止咳颗粒，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，依法测定各批次样品，计算清热止咳颗粒中芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和汉黄芩苷的含量，结果见表3。

3 讨论

清热止咳颗粒由14味中药组成，前期经过液相色谱-质谱(LC-MS)分析，按照成分类别主要为黄酮类、皂苷类、生物碱类和其他类。首先，皂苷类成分主要来源于方中的知母、桔梗、重楼和甘草，按照分析方法多需要ELSD来进行检测，用目前的UPLC-DAD系统不适合；其次，生物碱类成分主要来自方中的贝母，如贝母素甲和贝母素乙等属于生物碱类，因紫外末端吸收，《中国药典》2015年版采用ELSD检测器；第三，其他类成分，苍耳子主要成分为有机酸绿原酸和苍术苷，绿原酸出峰时间过快且含量较低，无法准确定量，而苍术苷需要ELSD检测；方中苦杏仁主要成分苦杏仁苷属于末端吸收的氰苷类成分，在207 nm下检测基线漂移较大；另外石膏主要成分为硫酸钙，紫苏叶主要成分为挥发油；第四，黄酮类成分，是最主要的一类成分，其中方中鸭跖草含有异荭草素、甘草含有甘草苷，但是两者含量较低，出峰响应不好，而方中的黄芩、陈皮和枳壳，其含有的芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷7个成分含量较高，色谱峰典型，同时黄芩中的黄芩苷具有抗炎、抗流感病毒等作用，陈皮中的指标性成分橙皮苷有抗病毒的作用，枳壳中的活性成分柚皮苷和新橙皮苷具有抗炎、抗氧化等药效，这些成分与清热止咳颗粒主要药效一致，因此选择了黄芩苷等7种成分进行同时测定。

表2 清热止咳颗粒7个分析物的回收率试验结果(n＝6)

表3 清热止咳颗粒中7个分析物的含量(mg·g-1)

检测波长的选择：通过对7个分析物进行DAD全波长扫描，芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的最大吸收波长为283 nm，黄芩苷的最大吸收波长为277 nm，木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷的最大吸收波长为273 nm，综合7种黄酮类成分在280 nm处均有良好的紫外吸收。因此，选择280 nm作为检测波长。

流动相选择：分别比较了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸水溶液系统及其不同比例梯度洗脱效果，结果发现用甲醇-水和甲醇-0.1%甲酸水溶液梯度洗脱时，7个黄酮类成分不能基线分离，柚皮苷、芸香柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷等成分互相干扰，而改用乙腈-水梯度洗脱时，7种成分分离良好，但是黄芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和汉黄芩苷的峰形不佳，进一步改用乙腈-0.1%甲酸水溶液洗脱时，7个成分的分离效果明显改善，且峰形较好，基线稳定。故最后采用乙腈-0.1%甲酸水溶液做为色谱流动相。

色谱柱的选择：分别考察了ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)、Thermo syncronis aQ 色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7μm)、CORTECSUPLC C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.6 μm)、Ultimate UHPLC XB-C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)色谱柱，结果表发现Acquity UPLC HSS T3 C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.8μm)在7个待测物的色谱峰峰形、分离度及保留时间上均优于其他3根色谱柱。

经过超高效液相色谱条件的优化，将同时测定的7种成分的分析时间压缩到15 min，单针的溶剂消耗少于6 mL，与同类的复方分析[11-13]相比，具有明显缩短分析时间和溶剂消耗。

通过分析方法学的验证，本试验验证了该方法的精密度、稳定性、重复性、线性范围和加样回收率等均符合分析要求。最后通过对7批次的清热止咳颗粒的含量测定，结果表明，黄芩苷的含量在6.590～6.977 mg·g-1，其含量是颗粒中最高的成分，来源于复方的黄芩药材；其次，柚皮苷的含量在1.719～1.772 mg·g-1，新橙皮苷的含量在 1.638～1.689 mg·g-1，含量较高的成分，这两种成分在枳壳和陈皮中均有分布，但是在陈皮中含量显著低于枳壳[14-15]，因此本次枳壳阴性样品中并未检测出此成分，提示复方中的柚皮苷和新橙皮苷主要来源于枳壳药材；第三，橙皮苷的含量在1.138～1.190 mg·g-1，芸香柚皮苷的含量在0.431 3～0.452 0 mg·g-1之间，从阴性样品分析来看，两种成分在复方中的枳壳和陈皮药材里均有分布，根据文献报道橙皮苷在陈皮中的含量显著高于枳壳[16-17]，但橙皮苷作为陈皮在《中国药典》2015年版中规定含量测定的指标性成分[18]，提示复方中的橙皮苷主要来自于的陈皮药材；第四，木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷含量在0.519 0～0.543 3 mg·g-1，汉黄芩苷的含量在0.539 8～0.580 5 mg·g-1，两者含量相当，来源于复方的黄芩药材。

根据中药质量标志物Q-marker理论[19]，现代药理研究表明黄芩苷能通过激活TLR7/MYD88信号通路，抑制 A型流感病毒感染小鼠肺炎症反应[20]；汉黄芩苷等黄芩的黄酮类成分也具有显著的抗炎活性[21]，枳壳中的柚皮苷类黄酮具有抗氧化应激的作用[22-23]，而陈皮中橙皮苷等黄酮可以通过AMPK信号通路调控细胞自主免疫，双向影响甲型流感病毒复制和传播[24]，提示清热止咳颗粒中7种黄酮类成分可能可以通过抗病毒、抗炎或者抗氧化应激发挥止咳、抗流感的作用，所测定的7个黄酮类成分的药理作用与清热止咳颗粒的临床功效相一致，因此黄芩苷等7个黄酮类成分是清热止咳颗粒重要的Q-marker成分。

综上所述，本试验所建立的UPLC同时测定清热止咳颗粒中芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和汉黄芩苷含量的方法操作简便、稳定、准确且可行，可以为清热止咳颗粒质控的提升提供参考。