固相萃取-高效液相色谱法测定化妆品中荧光增白剂

陈东洋， 张 昊， 冯家力*， 曾 栋， 袁春晖， 刘先军， 李帮锐

(湖南省疾病预防控制中心，湖南长沙 410005)

荧光增白剂(Fluorescent Whitening Agents，FWAs)是一种荧光染料，按化学结构可分为香豆素型、萘二甲酰胺型、吡唑啉型、苯并噁唑型和三嗪氨基二苯乙烯型，它们均能提高基体的白度和亮度[1，2]，被广泛应用于洗涤用品、纺织品、纸张、涂料、塑料等生产领域[3，4]。荧光增白剂含有芳香族胺基结构和苯乙烯结构，对人体肝脏、血液系统有极大的危害，长期接触存在致癌风险。基于消费者对化妆品的需求越来越大，尤其对美白类产品的需求日益剧增，而目前关于化妆品中荧光增白剂的检测报道较少，对化妆品中荧光增白剂的检测仍主要针对某一类型进行监测，如吕春华等[5]建立甲醇提取，高效液相色谱法直接测定面膜、眼霜、吸收液、香皂、粉底等7种基质化妆品中5种三嗪氨基二苯乙烯型荧光增白剂；Gu等[6]采用液相色谱-二极管阵列检测器和荧光检测器联用方法对化妆品中5种二苯乙烯型荧光增白剂进行含量测定等。因此，建立准确、可靠的化妆品中多种类型荧光增白剂同时测定的方法显得极为必要。

目前检测荧光增白剂的方法有定性和定量方法。定性方法主要有白度法[7]和紫外灯照射观测法[8，9]。定量方法有荧光分光光度法[9]、紫外分光光度法[10]、毛细管电泳法[11]、高效液相色谱法[12，13]和液相色谱-质谱法[14，15]等。本研究采用固相萃取柱对样液进行净化，通过优化前处理条件和色谱条件，建立固相萃取-高效液相色谱法测定化妆品中11种荧光增白剂。建立的方法灵敏、准确，适用于化妆品中11种目标荧光增白剂的同时测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1200液相色谱仪，附荧光(FLD)检测器(美国，Agilent公司)；超声波清洗仪(德国，Elnma)；TGL16高速冷冻离心机(长沙英泰仪器有限公司)；VORTE-X涡旋混匀器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。HLB固相萃取柱(500 mg/6mL)、C18固相萃取柱(500 mg/6mL)、MAX固相萃取柱和WAX固相萃取柱均购自美国Waters公司。

11种荧光增白剂：荧光增白剂VBL(Fluorescent Brightener 85,C.I.85)、荧光增白剂BA(Fluorescent Brighten 113,C.I.113)、荧光增白剂MST-H(Fluorescent Brightener 353,C.I.353)、荧光增白剂220(Fluorescent Brightener 220,C.I.220)、荧光增白剂5bm(Fluorescent Brightener 5bm,FWA 5bm)、荧光增白剂71(Fluorescent Brightener 71,C.I.71)、荧光增白剂BBF(Fluorescent Brightener 90,C.I.90)、荧光增白剂24(Fluorescent Brightener 24,C.I.24)、荧光增白剂SH(Fluorescent Brightener 210,C.I.210)、荧光增白剂264(Fluorescent Brightener 264,C.I.264)、荧光增白剂HST(Fluorescent Brightener 357,C.I.357)(福州绿川生物科技有限公司)。吸取标准储备液用40%乙腈稀释制备成10.0 mg/L标准中间液，临用前，用流动相稀释成相应的标准曲线浓度。按1.3色谱条件，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归分析。乙腈、乙酸乙酯、环己烷(色谱纯，Merk公司)，其他试剂除特别说明，均为分析纯。实验用水为经Millipore处理的一级水。

1.2 样品前处理

液体化妆品：取样品2.0 g于10 mL棕色离心管中，加入8 mL 40%乙腈溶液，涡旋，超声提取10 min，补充40%乙腈溶液定容至刻度，混匀后，8 000 r/min离心10 min，取上清液备用。

固体化妆品：取样品2.0 g于10 mL离心管中，加入4 mL乙腈分散，加入4 mL水，超声提取10 min，补充40%乙腈溶液定容至刻度，混匀后，8 000 r/min离心10 min，取上清液备用。

1.3 固相萃取

C18柱预先用5 mL甲醇，5 mL水活化，分别取5.0 mL上清液上样，用3 mL 40%乙腈淋洗，用7.0 mL 5%氨化甲醇(V/V)洗脱，洗脱液氮吹至近干，用色谱流动相定容至1.0 mL，涡旋溶解，待HPLC测定。

1.4 色谱条件

色谱柱：C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温：30 ℃，流动相：A为乙腈，B为30 mmol/L四丁基溴化铵水溶液；梯度洗脱程序0～6 min，50%A；5～12 min，50%～75%A；12～19 min，75%A；19～20 min，75%～50%A；20～25 min，50%A；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；检测波长：激发波长350 nm，发射波长430 nm。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

通过高效液相色谱-荧光检测器对荧光增白剂标准溶液进行激发波长光谱扫描，确定最大激发波长。同时，以最大激发波长在250～500 nm范围进行扫描，获得荧光增白剂的最大发射波长，从而确定荧光增白剂的激发波长为362 nm，发射波长为430 nm。

比较了离子对试剂四丁基溴化铵的浓度对分离效果的影响。分别添加10、20、30、40、50 mmol/L四丁基溴化铵于流动相中，发现当离子对试剂浓度不足时，容易出现峰前倾现象，四丁基溴化铵浓度为30 mmol/L时峰形最好。图1显示在优化后的色谱条件下，11种荧光增白剂能完全分离。

图1 荧光增白剂标准色谱图Fig.1 Chromatogram of FWAs standards 1：C.I.220，2：C.I.24，3：C.I.210，4：C.I.85，5：C.I.113，6：C.I.264，7：C.I.353，8：C.I.357，9：FWA5bm，10：C.I.90，11：C.I.71.

2.2 固相萃取条件的优化

2.2.1 固相萃取柱的选择考察了HLB、C18、WAX、MAX不同固相萃取柱对化妆品中荧光增白剂的净化效果。添加0.10 mL 10.0 mg/L混合标准溶液于空白样品中，按1.2步骤处理后测定，计算各固相萃取柱对荧光增白剂的回收率，见图2。结果表明C18柱回收率最高，为97.6%～101%，其次为HLB柱，回收率为74.2%～93.2%；而WAX柱和MAX柱回收率较差，分别为40.4%～74.2%和30.1%～56.8%，可能这两种萃取柱保留能力较强，难以洗脱。因此本文采用C18固相萃取柱净化化妆品中荧光增白剂。

2.2.2 洗脱溶剂的选择考察甲醇、乙腈、丙酮及氨化甲醇(5%，V/V)对FWAs的洗脱效果。称取2 g空白样品，加入0.10 mL 10.0 mg/L混合标准溶液，处理步骤如1.2，分别用10 mL上述溶液进行洗脱，比较不同洗脱溶剂的洗脱效率，见图3。结果表明氨化甲醇(5%，V/V)的回收率最高，FWAs的回收率为83.1%～101%；其次为丙酮，回收率为60.4%～88.8%，乙腈和甲醇的回收率相近，分别为52.1%～83.2%和46.2%～77.5%。因此选用氨化甲醇(5%，V/V)为洗脱剂。同时对洗脱体积进行了优化，采用3.0、5.0、7.0和10.0 mL氨化甲醇(5%，V/V)对FWAs进行洗脱。结果显示洗脱液达7.0 mL后，荧光增白剂的回收率趋于平稳，因此选用7.0 mL氨化甲醇(5%，V/V)为洗脱液用量。

图2 不同固相萃取柱对FWAs的回收率的影响Fig.2 The effect of different cartridge on the FWAs recoveries

图3 不同洗脱液对FWAs回收率的影响Fig.3 The effect of different elution on the FWAs recoveries

2.3 方法性能

2.3.1 线性范围及检出限在确定最佳测定条件下，11种FWAs在0.10～10.0 mg/L浓度范围线性关系良好，相关系数r≥0.9990。以仪器信噪比(S/N)为3时所对应的标准溶液浓度为仪器检出限，根据前处理方法，检出限为0.03～0.2 mg/kg(表1)。

表1 方法线性范围，回归方程及检出限

2.3.2 回收率及精密度在空白样品中添加3个浓度水平的混合标准溶液，每个添加浓度平行测定6次。按1.2进行前处理并分析，计算回收率和相对标准偏差(RSD)。结果见表2。11种组分回收率为82.2%～103%，RSD为3.1%～6.2%，结果表明建立的方法重复性好，回收率结果满意。

2.4 实际样品检测

采用本文建立的方法对市售的3种品牌护肤水、卸妆水、眼霜和面霜共11份化妆品样品进行测定，测定结果均低于方法检出限。

表2 方法的回收率和相对标准偏差(n=6)

3 结论

建立了固相萃取-高效液相色谱同时测定化妆品中11种荧光增白剂的方法。采用C18固相萃取柱对荧光增白剂进行净化，获得简单、快捷的前处理方法；同时对高效液相色谱分离检测条件进行优化。建立的方法检出限为0.03～0.2 mg/kg，回收率为82.2%～103%，RSD小于6.2%，重现性和准确性均能满足定量分析要求。该方法灵敏、可靠，适用于化妆品中11种荧光增白剂的同时测定。