新型二氧化硅纳米毛细管开管柱的制备及其电色谱性能的研究

刘元元， 李 静， 王 彦， 闫 超*,

(1.上海交通大学药学院，上海 200240;2.上海通微分析技术有限公司，上海 201203)

开管毛细管电色谱(Open Tubular Capillary Electrochromatography,OT-CEC) 是一种新兴的在毛细管内表面涂覆或键合固定相，以电渗流为主要驱动力的色谱微分离技术[1]。它兼具了毛细管电泳(Capillary Electrophoresis,CE)和高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)双重作用机理，与HPLC相比，柱塞型的电渗流代替压力流，可以抑制样品扩散、提高柱效，而且其开放型的分离通道可以避免液相色谱柱堵塞、重复性差等问题；与CE相比，由于毛细管柱表面色谱固定相的存在，可以发挥液相色谱的高选择性优势，同时还可以抑制样品的吸附，尤其是在生物大分子或碱性物质(带正电)的分离分析中具有极好的应用前景。

固定相是制备毛细管电色谱开管柱的核心和瓶颈。SiO2纳米材料，尤其是有序介孔SiO2纳米材料(Mesoporous Silica Nanoparticles,MS NPs)，不仅具有化学稳定性好、易于修饰、孔径分布窄、孔结构均一可调等特点[2,3]，而且具有出色的比表面积(>1 600 m2/g)[4]，可以用来接枝各种功能性基团或配体，如氨基[5]、巯基、烷基和环糊精[6]，近年来作为色谱材料被广泛地用于气相色谱[7]、液相色谱[4,8,9]、离子色谱[10]、亲和色谱[11，12]以及电色谱[13]等各个领域。例如，Tian等[14]利用合成的亚微米SBA-15制备电色谱填充柱，应用于苯类同系物、苯胺类化合物以及碱性药物的分离，柱效达210 000N/m。Dong等[15]利用纤维素修饰的基于MCM-41的开管柱，可以成功应用于安息香类化合物的手性分离。

本文设计并合成了一种基于纤维状介孔二氧化硅纳米(fSiO2)和聚合物(DMAEMA polymer)的材料(P-fSiO2)，将该材料通过物理吸附的方式涂覆到毛细管内壁，制备了新型的毛细管电色谱开管柱(P-fSiO2开管柱)。在考察电渗流等条件的基础上，并将其首次应用于磺胺吡啶(SP)等8种磺胺类碱性物质(图1)的开管毛细管电色谱(OT-CEC)分离分析，以考察其电色谱性能。磺胺类抗生素大多含有磺酰胺基和氨基等碱性基团，目前多采用反相高效液相色谱等[16]分离方法，而OT-CEC分离分析磺胺类化合物的方法在国内外还未见报道。

图1 8种磺胺的化学结构式Fig.1 Structural formula of 8 sulfonamides

1 实验部分

1.1 仪器、试剂和材料

S-4800场发射扫描电子显微镜(SEM)(日本，Hitachi公司)；JEOL-2100F场发射透射电子显微镜(TEM)(日本，电子株式会社)；Sartorius BT224S电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；KQ5200DE型超声波清洗(昆山市超声仪器有限公司)；D2F-1B真空干燥箱(上海博泰实验设备有限公司)；DF-101S集热式恒温磁力搅拌器(河南巩义市予华仪器有限责任公司)；DM36-12马弗炉(上海德恭实业有限公司)；电阻丝加热器(苏州环球色谱有限责任公司)。

磺胺吡啶(SP)、磺胺二甲基嘧啶(SM2)、磺胺二甲氧嘧啶(SDM)、磺胺喹恶啉(SQX)、磺胺甲氧哒嗪(SMP)、磺胺间甲氧嘧啶(SMM)、磺胺二甲异恶唑(SIZ)、磺胺嘧啶(SD)8种标准品购自阿拉丁试剂(上海)有限公司。磺胺标准溶液的配制：分别准确称取磺胺吡啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺喹恶啉、磺胺甲氧吡啶嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲异恶唑、磺胺嘧啶各10.0 mg，加入色谱纯乙腈定容至10.0 mL，配成浓度为1.0 mg/mL的标准储备溶液，用时取适量混合再稀释到所需浓度，过0.22 μm滤膜，并置于4 ℃避光保存。无水乙醇、丙酮、尿素、环己烷、异丙醇、硼砂、Na2HPO4、NaOH、HCl、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、正硅酸四乙酯(TEOS)等均购买于国药集团化学试剂有限公司(上海)；无水二氯甲烷、CuCl2、CuCl、2-溴异丁酰溴、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)、2,2′-联吡啶(BPY)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯(DMAEMA)等均购自阿拉丁试剂(上海)有限公司；甲醇、乙腈(色谱纯)购自Tedia公司。熔融石英毛细管(50 μm i.d.,363 μm o.d.)购自河北永年锐沣色谱器件有限公司。纯水由Milli-Q纯化系统(美国，Millipore)制备。

1.2 P-fSiO2的合成

首先合成纤维状介孔二氧化硅纳米材料(fSiO2NPs)。在装有磁力搅拌器、回流冷凝管、温度计和滴液漏斗的250 mL四颈瓶中，加入0.5 g(1.3 mmol)CTAB、0.3 g(5.0 mmol)尿素和15 mL纯水，开动搅拌使其溶解后，分别加入15 mL环己烷和0.46 mL(6.0 mmol)异丙醇，随后缓慢滴加1.25 g(6.0 mmol)TEOS并剧烈搅拌30 min，加热使溶液温度达到72 ℃，反应10 h。反应结束后,将反应液冷却至室温，以5 000 r/min离心3 min，用纯水和丙酮分别洗涤3次，60 ℃干燥24 h。最后将合成的固体转移至50 mL 0.6%NH4NO3-乙醇溶液中，60 ℃回流4 h除去模板剂CTAB。反应结束后，冷却至室温，用乙醇洗涤3次，60 ℃干燥24 h，得到白色纤维状介孔二氧化硅纳米材料(fSiO2)。

通过原子转移自由基聚合(Atom Transfer Radical Polymerization,ATRP)法将DMAEMA接枝到除去模板的fSiO2上。将1.0 gfSiO2加入到含有0.06 mol/L APTES的 50 mL无水乙腈中，25 ℃反应24 h。反应结束后，以5 000 r/min离心3 min，乙腈洗涤3次，60 ℃干燥得到氨基化fSiO2(NH2-fSiO2)。将1.0 g NH2-fSiO2加入到含有0.15 mol/L三乙胺，0.13 mol/L 2-溴异丁酰溴以及催化量DMAP的50 mL无水二氯甲烷中，25 ℃反应12 h。结束后，以5 000 r/min离心3 min，二氯甲烷洗涤3次，60 ℃干燥得到溴化-氨基化f-SiO2(Br-NH2-f-SiO2)。最后，将1.0 g Br-NH2-fSiO2加入到10 mL甲醇-水(2∶1,V/V)溶液中，超声溶解后，加入0.5 mol/L DMAEMA，0.08 mol/L BPY，0.006 mol/L CuCl2和0.02 mol/L CuCl，室温反应12 h后，用纯水洗涤至无色，60 ℃干燥得到DMAEMA-fSiO2(P-fSiO2)。

P-fSiO2的合成路线如图2所示。

图2 P-fSiO2合成示意图Fig.2 Synthesis DMAEMA-modified of silica nanoparticles

1.3 P-fSiO2开管柱的制备

毛细管预处理：将总长度65 cm，有效长度45 cm，50 μm i.d.的熔融石英毛细管依次用甲醇(30 min)、纯水(5 min)、0.1 mol/L NaOH溶液(60 min)、纯水(5 min)、0.1 mol/L HCl(30 min)、纯水(5 min)、甲醇(30 min)冲洗，以充分暴露毛细管内壁硅羟基，80 ℃干燥过夜后备用。P-fSiO2开管柱的制备：P-fSiO2开管柱的制备原理主要是利用P-fSiO2与负电性的石英毛细管壁之间的静电吸附(Electrostatic Attraction)作用。过程如下：2.0%P-fSiO2乙醇溶液以5.0 μL/min灌入活化干燥后的毛细管，持续5 min，70 ℃干燥12 h后，用纯水洗涤5 min，70 ℃干燥6 h得到P-fSiO2开管柱，备用。

1.4 毛细管电色谱条件

CE-1000毛细管电泳仪(Unimicro(Shanghai)Technologies,Shanghai,China)，由毛细管柱上检测器、高压电源及色谱工作站(Trisep-2003)组成；色谱柱：P-fSiO2开管柱(50 μm i.d，有效长度45 cm，总长度65 cm)；流动相：硼砂体系；进样量：电动进样10 kV、5 s；检测波长：254 nm；温度：25 ℃。

2 结果与讨论

2.1 色谱材料和开管柱的表征

透射电子显微镜(TEM)显示合成的P-fSiO2纳米材料为350 nm，如图3a所示。等温吸脱附线是研究多孔材料表面和孔的基本数据。如图3b所示，根据IUPAC分类的6种吸脱附等温线，该材料的N2吸附-脱附等温线属于“Ⅳ”型，脱附等温线在吸附等温线的上方，根据介孔回滞环的类型，为H3型迟滞环，迟滞环的存在说明材料堆积形成了介孔。对其比表面积的分析一般采用Brunauer-Emmett-Teller(BET)方法，比表面积是544.56 m2/g，孔径分布通常采用Barrett-Joiner-Halenda(BJH)模型，计算得到的平均孔径分布为3.41 nm。

图3 P-fSiO2的透射电镜(TEM)图(a)和fSiO2的N2吸附-脱附等温线(b)Fig.3 TEM image of P-fSiO2(a) and nitrogen adsorption-desorption isotherm of fSiO2(b)

2.2 P-fSiO2开管柱的表征

扫描电子显微镜(SEM)是表征毛细管内壁形态的有效方法，图4a以及其局部放大图4c显示，空管的内壁形态光滑、无涂覆迹象；而P-fSiO2开管柱的SEM图(图4b、4d)，显示有一层明显的颗粒状固定相的存在，局部放大(图4d)显示填料的粒径大小同图3a。

图4 空管(a)、P-fSiO2开管柱(b)的扫描电镜(SEM)以及局部放大(c、d)图Fig.4 SEM images of bare capillary(a),P-fSiO2 column(b) and magnified SEM(c,d)

2.3 P-fSiO2开管电色谱柱的性能评价

2.3.1 电渗流的考察在电色谱技术中，电渗流(EOF)作为流动相的主要驱动力，其大小直接影响色谱分离效果。本实验以二甲基亚砜(DMSO)为电渗流标记物，如图5所示，P-fSiO2开管柱的电渗流随pH值的降低而减小，且在相应pH点的电渗流值均小于毛细管空管，尤其是在碱性pH条件下，电渗流值显著降低。因此，基于P-fSiO2涂层材料对电渗流的抑制作用，或许可以在碱性样品的分离分析中得到良好的应用，接下来本文选取磺胺类碱性化合物作为P-fSiO2开管柱性能考察的标的物。

图5 缓冲液pH对空管和P-fSiO2开管柱的电渗流的影响Fig.5 Effect of buffer pH on EOF of bare capillary and P-fSiO2 open-tubular columnconditions:bare capillary and P-fSiO2 column(50 μm i.d.,65/45);running buffer:30 mmol/L sodium borate,pH=4.0 - 9.0;voltage:-18 kV;temperature:25 ℃;sample,DMSO;detection:220 nm.

2.3.2 缓冲盐及浓度的考察在考察电渗流的大小及方向的基础上，本文首先考察了磷酸盐和硼砂缓冲溶液等不同体系的影响。结果表明，在磷酸盐缓冲体系中，基线不稳定；且同等浓度的缓冲盐，硼砂的离子强度小，有利于避免较大焦耳热的产生。综合考虑，选择硼砂缓冲溶液作为运行缓冲液。随着硼砂缓冲盐浓度的增加，双电层厚度增加，电渗流降低，带电溶质在开管柱内的迁移速率变慢，同时较大的离子强度增大了焦耳热，不仅影响基线的稳定而且影响实验的重复性。实验考察了不同浓度缓冲溶液(25～40 mmol/L)的影响(图6)。当缓冲液浓度为40 mmol/L时，缓冲液离子强度大，表观电流显著增大，焦耳热增大，溶质扩散加剧，峰形展宽；当使用较低浓度缓冲液(25 mmol/L)时，迁移时间虽然较快，但峰高响应有所降低，检出灵敏度有所下降。综合考虑，实验优化的硼砂缓冲液浓度为30 mmol/L。

2.3.3 分离电压的考察分离电压主要影响分析时间与分离效果两个方面。在30 mmol/L硼砂缓冲体系下，经过实验考察(图7)，当分离电压低于16 kV时，分离度增加，但分析时间稍长。当电压高于20 kV时，分析时间缩短，但分离度变差，并且此时由于焦耳热效应明显，基线波动较大，使整个检测体系较不稳定。因此，综合分离度、分析时间和缓冲体系稳定性等多方面的影响，实验选择的分离电压为16～20 kV之间。

图6 缓冲液浓度对P-fSiO2开管柱分离效果的影响Fig.6 Effect of buffer concentration on the seperation efficiency of OTCEC on P-fSiO2 open-tubular columnconditions:P-fSiO2 column(50 μm i.d.,65/45);running buffer:25 - 40 mmol/L sodium borate,pH=9.0;voltage:-15 kV;temperature:25 ℃;detection:254 nm.peak identification:1.SP;2.SM2;3.SDM;4.SQX;5.SMP;6.SMM;7.SIZ;8.SD.

图7 电压对P-fSiO2开管柱分离效果的影响Fig.7 Effect of high voltage on the seperation efficiency of OTCEC on P-fSiO2 open-tubular columnconditions:P-fSiO2 column(50 μm i.d.,65/45);running buffer:30 mmol/L sodium borate,pH 9.0;voltage:12 - 20 kV;temperature:25 ℃;detection:254 nm;peak identification.1.SP;2.SM2;3.SDM;4.SQX;5.SMP;6.SMM;7.SIZ;8.SD.

2.3.4 缓冲液pH的考察在不同的pH环境中，因分子解离程度的不同会造成待测物的电泳速率的差异，因此缓冲液的pH是分离过程中的重要考察因素。磺胺类化合物含有磺酰胺基和氨基等碱性基团，大部分pKa在5～8之间(pKa：SP,8.4；SM2,6.05；SDM,6.8；SQX,5.5；SMP,7.2；SMM,6.05；SIZ,4.83；SD,6.5)。在优化的条件(30 mmol/L硼砂缓冲液，16 kV)和预实验基础上，本文选取了7.0、8.0以及9.0三个点考察pH对磺胺分离的影响。如图8所示，与pH=8.0的缓冲液相比，当缓冲液pH=7.0时，虽然峰1与8的分离度变大，但是分离时间稍长(～60 min)，且峰4～6的分离度变差，峰7出现了前移的现象；当缓冲液pH=9.0时，分离时间虽有所缩短，但峰1～8整体的分离度变小。因此，实验选取缓冲液的较佳pH条件为8.0。

2.3.5 与空管比较在优化的分离条件下(30 mmol/L硼砂缓冲液，18 kV，pH=8.0)，实验比较了P-fSiO2开管柱与空管的分离能力。如图9所示，没有涂层的毛细管柱(即电泳模式)虽然出峰较快(时间为9～11 min)，但很难实现对8种磺胺的分离；而同样的实验条件下，P-fSiO2开管柱(即电色谱模式)由于涂层材料的存在，不仅可以实现对8种磺胺的良好分离(出峰时间为14～31 min)，而且SQX的柱效高达228 542N/m(表1)。我们推测，在P-fSiO2开管电色谱分离模式中，胺基聚合物材料的存在，对磺胺可能展现了一定的氢键和疏水性作用。

表1 8种磺胺的柱效数据

2.3.6 重复性在相同条件下，将同一根柱子在1 d内连续进样6次，计算出峰时间的日内精密度(RSD%,n=6)；同一根柱子连续6 d，每天进样6次，计算出峰时间的日间RSD(%,n=6)；同时选取5根柱子以标记物的出峰时间计算柱间RSD(%,n=5)，结果如表2所示。8种磺胺的日内RSD值小于4.3%，日间RSD小于4.9%，柱间RSD为2.2%。说明，P-fSiO2开管柱具有良好的稳定性，且对磺胺类物质的分离具有良好的重现性。

图8 缓冲液pH对P-fSiO2开管柱分离效果的影响Fig.8 Effect of buffer pH on the seperation efficiency of OTCEC on P-fSiO2 open-tubular columnconditions:P-fSiO2 column(50 μm i.d.,65/45);running buffer:30 mmol/L sodium borate,pH 7.0 - 9.0;voltage:-16 kV;temperature:25 ℃;detection:254 nm;peak identification.1.SP;2.SM2;3.SDM;4.SQX;5.SMP;6.SMM;7.SIZ;8.SD.

图9 磺胺类化合物在P-fSiO2开管柱与空管中的分离效果Fig.9 Separation of sulfmides in P-fSiO2 open-tubular column and bare capillaryconditions:bare capillary and P-fSiO2 column(50 μm i.d.,65/45);running buffer:30 mmol/L sodium borate,pH=8.0;voltage:-18 kV;temperature:25 ℃;detection:254 nm;peak identification.1.SP;2.SM2;3.SDM;4.SQX;5.SMP;6.SMM;7.SIZ;8.SD.

表2 P-fSiO2开管柱的日内、日间以及柱间重复性

N/A,NotApplicable.

3 结论

本文采用物理吸附的方式，将合成的P-fSiO2材料涂覆到毛细管内壁，制备了一种新型的毛细管电色谱P-fSiO2开管柱，并将其应用于磺胺类物质的OT-CEC分离分析以验证其电色谱性能。P-fSiO2开管柱的制备方法简便、快捷、涂层稳定。通过对缓冲溶液浓度、pH值以及分离电压等因素的考察，可以实现对8种磺胺类化合物的分离，且重复性好。因此，基于P-fSiO2柱的OT-CEC方法有望在磺胺类等碱性物质的分离分析中得到良好的应用。