还原氨氧化衍生法结合高效液相色谱-荧光法检测葡萄酒中三种芳香醛

茅 龙， 汪 耀， 何振宇*， 林亚维*

(1.武汉理工大学化学化工与生命科学学院，湖北武汉 430070；2.武汉市洪山区疾病预防控制中心，湖北武汉 430060)

在葡萄酒的酿造和陈化中，氧化作用十分重要，它可改变葡萄酒色泽和香气并产生多种挥发性物质[1 - 3]，这些物质就含有芳香醛类化合物。芳香醛虽然在葡萄酒中含量较低，但可对葡萄酒的香气产生很大影响[4，5]，因此对葡萄酒中的芳香醛进行检测是极具意义的。醛类化合物检测常用的方法是气相色谱-质谱法(GC-MS)和液相色谱法(LC)。GC-MS法具有良好的分离和检测的能力，但醛类化合物的稳定性差，需要对其进行衍生[6 - 12]。而且葡萄酒基质较为复杂，还需要复杂的样品前处理步骤，如固相萃取、固相微萃取[13 - 15]等。此外，GC-MS法仪器价格较为昂贵，这也限制了该方法的广泛应用。相较于GC-MS法，高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FLD)受基质影响较小，但部分醛类化合物荧光较弱，因此可通过衍生化来增强其光学响应。荧光衍生试剂衍生结合HPLC-FLD法检测可极大提高检测灵敏度，常用试剂有丹磺酰肼(DNSH)[16，17]，但是该法通常需要加热不利于挥发性醛类，而且产物还存在同分异构现象。

本研究利用荧光衍生试剂4-氨氧基甲基-7-羟基-香豆素(AOHC)，发展了一种新型醛类荧光衍生化方法，利用硼烷-2甲基吡啶络合物(2-PB)[18]的还原作用可以得到结构单一的衍生产物(图1)。我们通过对多个衍生条件参数的优化得到了较高的衍生化效率，并将该方法成功用于葡萄酒分析。本方法分离效果好，准确性高，不需要复杂的萃取步骤，为葡萄酒中芳香醛类合物的分析提供了一种可行的方法选择。

图1 4-氨氧基甲基-7-羟基-香豆素(AOHC)标记芳香醛示意图Fig.1 Derivatization of aromatic aldehyde with 4-((aminooxy)methyl)-7-hydroxycoumarin(AOHC)

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

LC-20AT高效液相色谱仪(日本，Shimadzu公司)；LS-55荧光分光光度计(美国，Perkin Elmer公司)；纳升电喷雾离子源-Triple TOFTM5600质谱仪(美国，AB SCIEX公司)；PB-10 pH计(德国，Sartorius公司)。

4-氨氧基甲基-7-羟基-香豆素(AOHC)由本实验室合成；苯甲醛(B1)、磷酸、冰HAc(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；丁醛(C4)、戊醛(C5)、己醛(C6)、乙酸胺、2-氨基-5-甲氧基-苯甲酸、硼烷-2-甲基吡啶络合物(2-PB)(分析纯，北京百灵威科技有限公司)；庚醛(C7)、苯乙醛(B2)、苯丙醛(B3)、二甲基亚砜(DMSO)(分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；乙腈(色谱纯，美国TEDIA公司)；纯水(经Milli-Q系统纯化)。

葡萄酒样品购置当地超市。

1.2 实验方法

1.2.1 AOHC的荧光性质分析在1 mL DMSO中溶解2.07 mg AOHC，再用10%乙腈水溶液稀释至2 μmol/L。测量发射波长时，设定激发波长为325 nm，扫描波长范围为350～600 nm；测量激发波长时，设定发射波长为480 nm，扫描波长范围为250～450 nm。

1.2.2 AOHC与三种芳香醛衍生反应将10 μL混合醛(苯甲醛、苯乙醛和苯丙醛各0.01 mmol/L，溶于纯甲醇)与20 μL 0.1 mmol/L的AOHC(溶于纯甲醇)，加入到1.5 mL EP管中，再向其中加入10 μL HAc-NH4Ac缓冲液 (0.1 mol/L，pH=5.0)和10 μL 20 mmol/L 2-氨基-5甲氧基-苯甲酸(溶于纯甲醇)，混合均匀后，置于25 ℃的水浴锅中反应10 min，然后离心真空干燥，再加入25 μL的2-PB(0.4 mol/L，纯乙腈溶剂)和25 μL的磷酸溶液 (1.25 mol/L，纯乙腈溶剂)，于室温下反应5 min，然后取出离心真空干燥，最后加入50 μL水，待HPLC-FLD分析。

1.2.3 高效液相色谱条件ZORBAX Eelipse XDB-C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm;美国Agilent)；流动相A为纯水，流动相B为乙腈；洗脱程序为：0～10 min，30%B；15～30 min，95%B；33～38 min，30%B。 荧光检测器的激发和发射波长分别设定为325与480 nm；柱温：30 ℃；进样体积：20 μL；流速：1 mL/min。

1.2.4 高分辨质谱分析采用纳升电喷雾离子源-Triple TOFTM5600(AB，SCIEX)质谱仪对所有的衍生产物进行质谱分析。质谱分析采用的是正离子模式，二级质谱分析采用的是IDA(Information Dependent Acquisition)模式。Peak View 1.2 软件用于分析所得到的数据。

1.2.5 葡萄酒样品的衍生反应取200 μL酒样过0.22 μm滤膜并用甲醇稀释10倍后，进行AOHC衍生，衍生操作见1.2.2，最后直接进样分析。

2 结果与讨论

2.1 AOHC荧光特性

首先对 AOHC荧光性质进行表征，结果见图2，确定了激发和发射波长分别为325 nm和480 nm。然后对AOHC的荧光量子产率进行测定(以硫酸奎宁为标准参照物)，最终测得荧光量子产率为0.63，这说明AOHC具有良好的荧光特性。实验对3种衍生产物进行了荧光性质的测定(图2)，3种芳香醛衍生物的荧光激发发射波长与AOHC相似，说明衍生反应没有改变AOHC的荧光性质。

2.2 衍生产物的确定

使用HPLC-FLD对芳香醛衍生反应产物进行检测，见图3。对比空白样与反应样的色谱图，观察到3个可能的产物的色谱峰，保留时间分别为6.1、9.0和13.0 min。

对图3中这3个色谱峰依次进行质谱鉴定，3个色谱峰的[M+H]分别为m/z298.10、312.12和326.14，这与三种芳香醛衍生物的[M+H]+理论值吻合。此外，我们在3种衍生物的二级质谱图中均观察到了m/z176.04的碎片峰，如图4所示。这个碎片峰是AOHC的特征碎片峰，进一步表明了AOHC成功地对三种芳香醛进行了标记。

图2 AOHC与三种芳香醛衍生产物荧光光谱图Fig.2 The fluorescence spectra of isolated AOHC,B1-derivative,B2-derivative and B3-derivative

图3 3种衍生产物AOHC-B1、AOHC-B2和AOHC-B3色谱图Fig.3 Chromatogram of AOHC-B1,AOHC-B2 and AOHC-B3(2 μmol/L each)

图4 AOHC-B1(A)、AOHC-B2(C)、AOHC-B3(E)衍生产物一级质谱图；AOHC-B1(B)、AOHC-B2(D)和AOHC-B3(F)二级质谱图Fig.4 ESI-MS of AOHC-B1(A),AOHC-B2(C) and AOHC-B3(E) derivatives;ESI-MS/MS of AOHC-B1(B),AOHC-B2(D) and AOHC-B3(F) derivatives

2.3 还原氨氧化反应条件的优化

首先，在采用4 mmol/L 2-氨基-5-甲氧基-苯甲酸[23]为催化剂的条件下，对第一步氨氧化反应的其他条件进行了优化(图5A～D)，包括反应时间优化，反应体系pH值优化，反应温度优化和AOHC浓度优化。最佳的反应条件为：氨氧化反应时间为10 min，反应体系的pH为5.0，反应温度为25 ℃，AOHC浓度为40 μmol/L。在完成对第一步肟化反应的优化后，对第二步还原氢化进行了优化(见图5E～H)。主要包括还原反应时间优化、还原反应温度优化、磷酸浓度和2-PB浓度优化。最佳的还原条件为：反应时间为5 min，反应温度为25 ℃，磷酸浓度为0.625 mol/L，2-PB浓度为200 mmol/L。

图5 不同反应条件对产物峰面积的影响。(A) 氨氧化反应时间影响,(B) 反应体系pH影响,(C) 氨氧化反应温度影响,(D) AOHC浓度影响,(E) 反应时间影响,(F) 反应温度影响,(G) H3PO4浓度影响,(H)2-PB浓度影响Fig.5 Effect of derivatization conditions on peak areas of the derivatives,including(A) effect of the oximation reaction time,(B) effect of buffer pH,(C) effect of the oximation reaction temperature,(D) effect of the concentration of AOHC,(E) effect of the reducation reaction time,(F) effect of the reducation reaction temperature,(G) effect of the concentration of H3PO4,(H) effect of the concentration of 2-PB

2.4 分析方法的验证

标准曲线是通过分析不同浓度的标准芳香醛混合物的峰面积而建立起来的，分别计算检出限(LOD，S/N=3)和定量限(LOQ，S/N=10)。线性是由从LOQs开始到2 μmol/L不同混合醛浓度计算得出。日内精密度(RSD)在1 d之内连续测6个相同的反应样，日间RSD是使用相同的分析方法，每天测6个样，连续测3 d。3种芳香醛化合物的浓度范围、线性方程、相关系数以及检测限见表1。

表1 AOHC分析3种芳香醛所得线性范围、线性方程、相对标准偏差和检出限

aY:peakarea(mV·min)，X:concentration(nmol/L).

图6 (A) 苯甲醛、苯乙醛、苯丙醛和4种脂肪醛与AOHC衍生产物色谱图(其中B1为苯甲醛，B2为苯乙醛，B3为苯丙醛，C4为丁醛，C5为戊醛，C6为己醛，C7为庚醛);(B) 葡萄酒样品与AOHC衍生产物HPLC-FLD色谱图((a) 未加标实际样品,(b) 加标实际样品 (B1、B2加标浓度分别为0.2 μmol/L))Fig.6 (A) Representative chromatogram of a standard mixture of 3 aryl aldehydes spiked with 8 aliphatic aldehydes and 2 monosaccharides.Shown are the derivatives of C3,C4,B1,B2,C5,B3,C6 and C7;(B) Typical chromatograms for the determination of aryl aldehyde using the proposed method(a) unspiked wine sample,(b) wine sample spiked with B1 and B2 standards(0.2 μmol/L respectively)

2.5 抗干扰实验

考虑到实际样品中其他醛类化合物的存在会对芳香醛类化合物的检测产生干扰，将丁醛、戊醛等4种脂肪醛和3种芳香醛化合物混合，然后再进行衍生，采用HPLC-FLD进行分析检测。并对之前的色谱分离条件进行了调整，其结果如图6所示。我们可以看到所有醛类化合物的衍生产物都得到了良好的分离，这说明AOHC可以与不同的醛类化合物进行反应，并产生色谱特性不同的稳定的衍生产物。

2.6 实际样品分析

将该方法应用于葡萄酒样品中的芳香醛检测。将处理后的葡萄酒与AOHC直接进行衍生，然后进行HPLC-FLD分析。在葡萄酒样品中，检测到了苯甲醛和苯乙醛，并没有检测到苯丙醛。这两种产物峰分离效果较好，没有受到基质影响。采用外标法，对葡萄酒样品中的芳香醛进行了定量分析。结果显示，葡萄酒样品中苯甲醛和苯乙醛含量分别为0.12、0.18 mg/L。这一结果与Moreira等人[24]利用GC-MS法所测结果相似。本方法常温下衍生即可检测，不需任何萃取步骤，极大地简化了分析流程。其他结果如表 2所示，回收率为94.08%～107.54%，日内精密度(RSD)为2.25%～4.50%，日间RSD为4.03%～6.07%，表明该方法准确度高。

表2 葡萄酒样品中醛类物质的回收率，相对标准偏差及含量

arecovery(%)：average±SD。

2.7 与DNSH衍生法的比较

将AOHC衍生法与常用的DNSH衍生法进行了比较，分别比较了3种芳香醛与AOHC和DNSH标记的效果。首先比较了AOHC与DNSH衍生产物的色谱峰，AOHC衍生之后，每种芳香醛仅生成1种衍生物，而DNSH衍生后每种芳香醛都生成了2种衍生产物。

比较了DNSH与AOHC标记之后3种芳香醛衍生物的峰面积大小，AOHC对于3种芳香醛的衍生效果较DNSH要好，其衍生产物的荧光强度是DNSH衍生产物的13倍以上。

3 结论

本文采用荧光试剂AOHC,发展了一种新型醛类衍生化方法并将之成功应用于葡萄酒中芳香醛的检测。通过衍生条件优化，三种芳香醛衍生效率在89.6%以上。与常用的DNSH衍生化法相比，本方法可以在室温下进行并生成结构单一的，具有良好色谱、荧光性质的醛类衍生产物。采用该方法对葡萄酒中芳香醛进行测定，成功检测出0.12 mg/L的苯甲醛与0.18 mg/L的苯乙醛。该法操作简单，无需萃取富集步骤，极大地节约了时间和分析成本，在醛类化合物检测中极具应用前景。