骨复生对激素性股骨头坏死大鼠血清中VEGF、BALP、BGP表达的影响*

王军威 ，刘德玉，欧国峰，董 博 ，袁普卫 ，王国柱，肖 斌，陈 瑞，YAROV ABDULRAKHIM(哈萨克斯坦)

1.陕西中医药大学(咸阳 712000)；2.陕西中医药大学附属医院(咸阳 712000)；3.陕西中医药大学第二附属医院骨科(咸阳 712046)

激素性股骨头坏死(Steroid-indueed avascular necrosis of the femoral head,SANFH)属非创伤性股骨头坏死，常见原因为股骨颈骨折、激素及酒精，属骨坏死中最常见的一类，其致残率极高，严重影响人们的生活质量及水平[1-4]。祖国医学认为股骨头坏死属“骨蚀”、“骨痿”等范畴，股骨头部络脉细微，气血不足，外感六淫及内生五邪引起骨络不通，经气不得以上乘养筋骨，骨失津润而致萎痹；反之经络运行畅通，气血得以上乘，骨受气血津润，则经络通、骨萎痹除。成骨-成血管偶联是指血管再生与骨生成这两种生物学进程：由血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)轴调控的成骨-成血管偶联来维持骨微环境的平衡，不管成骨还是成血管偶联受损均可致骨的发育与重塑受限[5-7]。那么，骨复生是否通过影响成骨-成血管偶联调控因子(BALP-VEGF-BGP) 对早中期激素性股骨头坏死起到治疗作用的，目前不得而知。因此，本研究拟通过动物实验观察骨复生对早中期激素性股骨头坏死的可能作用机理及对血清中血管内皮生长因子(VEGF)、骨碱性磷酸酶(Bone alkaline phosphatase,BALP)、骨钙素(Bone Gla-protein,BGP)的影响，以期为中医药防治股骨头坏死提供一定的理论依据。

材料与方法

1 动 物 160只4月龄普通级SD大鼠(雌雄各半)，体重约在(280±40) g。所有动物均按中国动物实验标准进行采购，由西安交大医学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(陕)2017-004。

2 药 物 骨复生胶囊(规格：0.4 g×50粒，50粒/瓶，由陕西中医药大学附属医院中成药房提供)由鹿角胶15 g，三七6 g，虫、牛膝、延胡索各12 g，黄芪30 g等组成；阿仑膦酸钠片(福善美)，国药准字H10980109，石药集团欧意药业有限公司。

3 主要试剂与仪器 甲泼尼龙琥珀酸钠，国药准字H20040845,国药集团容生制药有限公司；Mouse VEGF ELISA Kit(批号:2695R)、Anti-BALP Antibody(批号:RT201)、Anti-BGP(Osteocalcin) Antibody，脂多糖，北京索莱宝科技有限公司；超速低温离心机,德国(Eppendorf)；石蜡切片机,德国莱卡2135型；电子显微镜,日本(OLYMPUS)。

4 造模及干预方法

4.1 造模方法：建立早中期激素型股骨头坏死模型，造模参照贺西京造模法[8]以及我们前期研究的方法[9]进行改良，中药治疗组、实验对照组及模型组大鼠在喂养1周后给予尾静脉注射脂多糖(50 μg/kg)，连续注射3 d后每隔2日进行甲泼尼龙琥珀酸钠(20 mg/kg)臀肌注射(统一从右侧臀大肌以45度角匀速注射)，隔日1次，连续注射8周后随机抽取各组大鼠各2只进行股骨头坏死模型鉴定，以股骨头组织HE染色为参考，镜下观察其切片有空骨陷窝形成或骨细胞核聚集，伴有周围骨髓细胞坏死征象，有1处坏死区域即可判断造模成功[10]。

4.2 治疗方法：造模成功后，中药治疗组给予骨复生胶囊水溶液2 ml(约480 mg/ml)灌胃治疗，实验对照组则给予2 ml(约1.29 mg/ml)阿仑膦酸钠片水溶液灌胃治疗，模型组给予生理盐水2 ml灌胃治疗，每天1次，连续灌胃8周。正常不给予治疗，正常饲养2周后处死取材。

4.3 观察指标及方法

4.3.1 影像学检查:随机抽取20只大鼠(每组各5只)，选取俯卧位，冠状位，核磁共振(MRI)IR快速反转序列扫描，观察各组大鼠髋关节治疗前后的影像学改变。

4.3.2 组织病理学检测:各组股骨头标本(双侧)沿股骨头正中切开，固定24～48 h(4%多聚甲醛溶液)→脱钙3～4周(10%EDTA)→包埋、切片、HE染色→观察骨小梁结构、骨细胞等的结构形态变化(电子显微镜)。

4.3.3 血清骨代谢标志物(VEGF、BALP、BGP)表达情况:采用乙醚麻醉SD大鼠，待麻醉满意后，用微量采血管从大鼠眼眶下静脉丛处取血，将采血管置于低速离心机(4 ℃，3500 r/min)离心5 min后取得上清液，采用酶联免疫吸附法(ELISA)分别对各组血清的相关骨代谢标志物进行检测。

5 统计学方法 用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，结果以平均值±标准差表示，先以方差分析，若组间有差异，组间比较用q检验，方差不齐者采用秩和检验或者χ2检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 动物一般情况 空白组大鼠除了体重有所增加外，其他(精神状况、毛发颜色等)均无明显异常变化；模型组大鼠精神状况比较差，毛发颜色晦暗并且没有光泽，体重下降显著，偶有毛发脱落等；中药治疗组、实验对照组大鼠精神状况尚可，毛发颜色较正常组稍差，体重轻微下降，但中药组大鼠一般情况更接近于正常组。

2 各组大鼠双侧髋关节MRI图像变化 空白组未见明显异常信号；模型组股骨头出现中点状或片状样中高等信号，周围环绕不均匀低信号，呈典型双线征，关节腔内有少量积液；中药治疗组髋关节周围偶有T2稍高信号，关节内未见T2高信号，股骨头形态规则，与软骨界限分明；实验对照组可见髋关节周少许T2高信号，关节内偶有T2高信号，股骨头形态尚规则，与软骨界限大致分明(图1)。

图1 各组髋关节(冠状位)MRI扫描结果(白色箭头所指为差异性表达区域)

3 各组大鼠股骨头HE染色后组织病理学改变空白组股骨头软骨厚度正常，软骨细胞排列有序，结构整齐；模型组股骨头软骨细胞大面积出现坏死，排列不整齐，软骨细胞核聚缩，骨小梁内骨细胞明显减少，空骨陷窝明显增多。中药治疗组股骨头软骨细胞排列尚规则，结构尚完整，少有空骨陷窝，但实验对照组多见，与正常组有较大差异(P<0.05)(图2)。

4 各组大鼠血清中VEGF、BALP、BGP含量表达情况 见表1。中药治疗组和实验对照组在治疗8周后与模型组相比血清中VEGF、BALP、BGP含量表达均升高，且中药治疗组在治疗8周后VEGF、BALP、BGP含量比实验对照组升高更显著，差异具有统计学意义(P<0.05)。说明骨复生与阿仑磷酸钠能同时升高血清中VEGF、BALP、BGP含量来增强成骨细胞活性，促进VEGF发挥其成血管作用，促进BALP、BGP升高增加成骨细胞活性，提高骨代谢率，促进骨质正常钙化，随着治疗时间的延长，骨复生的疗效更佳。

图2 各组动物股骨头光镜下HE染色结果(HE染色,×400)

表1 各组大鼠血清中VEGF、BALP、BGP的含量表达情况

注:与模型组比较,*P<0.05;与实验对照组治疗8周后比较,△P<0.05

讨 论

激素性股骨头坏死又属股骨头坏死中最常见的类型[11-13]。属骨科三大疑难病之一，且明确诊断后未及时正确治疗2年内股骨头塌陷率极高，而对于塌陷后的股骨头及其临床治疗效果和预后均不甚理想[14]。如何正确选择并进行早期的治疗一直是骨科学术界的难题，早期诊断、选择有效治疗方法，如药物的选择或者保髋手术选择，不仅可以减轻患者的临床症状，延迟病程，还有治愈本病的可能，因此，本次研究具有重大意义。祖国医学认为股骨头坏死的局部表现是其全身性病变的一部分，患者存在全身性的改变，西医治疗本病以解决关节局部病变为主，然而临床上患者体质差异、基础疾病不同，其病因病机也有一定差异，仅考虑局部症状，不改善全身状况，是无法治愈股骨头坏死的。祖国医学在辨证论治的理念及整体观念规范下，将患者的局部表现与全身状况进行点到面的统筹分析，得出明确的“证”，随后针对性的用方，进行整体、综合性调节，做到“标本兼治，多靶点作用”， 既能改善患者的整体状况，又可以保留股骨头，具有无法比拟的治疗优势，大量的临床及基础研究资料也已证实其安全性和有效性[15-18]。目前，治疗股骨头坏死的中药已达100种以上，因此，研究一组治疗效率高、服用剂量小、使用方便、毒副作用底的特效中药组合，势在必行。

“骨复生”是陕西省名中医刘德玉教授经多年临床经验总结出来治疗股骨头坏死的经验方，本着以“补肾活血”为大法，已成为陕中附院的院内治疗多类股骨头坏死并取得了显著疗效[19-21]的方法。方中三七和鹿角霜共为君药，活血化瘀，补益肝肾；牛膝强壮筋骨，虫破血化瘀，续筋接骨，共为佐药，以增强君药之补肾强筋、化瘀止痛之功效；黄芪补气、当归补血，方药组成合理，针对性强，能达补肾壮筋骨，促进骨愈合，防治骨坏死之功。成骨性细胞“成骨”、血管内皮细胞“成血管”及VEGF轴对成骨性细胞和血管内皮细胞的调控作用使之达到一个平衡来维持骨的发育与重建[22-26]，由此我们推断股骨头坏死与成骨-成血管偶联内在之间存在某种对应的联系。

通过本次实验研究我们发现激素可同时降低SD大鼠血清中VEGF、BALP、BGP含量，影响股骨头坏死组织的自身修复，而骨复生能同时升高SANFH大鼠血清中VEGF、BALP、BGP表达的含量，增强成骨-成血管偶联调控因子含量的表达，达成“成骨→活血生骨方→成血管”的微循环平衡，改善股骨头局部血管内环境[27-30]，促进SD大鼠股骨头坏死骨修复及股骨头新生骨的生成，且随着治疗时间的延长作用越强。