健脾益肾方对非小细胞肺癌细胞体外增殖凋亡作用的实验研究*

梁应凤，郭姗姗，张 丹，卢敬钗，叶 奇，高 燕，李 倩△，Latimer N

1.解放军火箭军特色医学中心(北京 100088)；2.英国谢菲尔德大学健康与健康研究学院卫生经济学和决策科学(谢菲尔德市 S1 4DA)

非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)作为最常见的肺癌类型，早期诊断特征不显著，确诊时多已处于局部晚期或晚期[1]。针对NSCLC的传统治疗模式(手术、放化疗)目前处于瓶颈阶段，患者5年生存率极低；而兴起的分子靶向治疗亦存在较大局限[2]。因此，寻找可行诊疗方法对于提高NSCLC患者疗效至关重要。目前，医学界对传统中医学的重视，使其在恶性肿瘤的治疗方面的功能重新受到重视[3]。健脾益肾方以黄芪、党参、白术、当归、茯苓、旱莲草、女贞子等配伍，具有健脾胃、补肾经、补气扶正及提升机体免疫功能等功效，可有助于辅助放化疗等治疗各类疾病，包括肿瘤如乳腺癌[4-5]。在分子生物学领域，恶性肿瘤细胞的增殖、凋亡等生物学特征与肿瘤的恶性发展密切相关。本研究旨在探讨健脾益肾方对NSCLC细胞体外增殖凋亡作用，以期为NSCLC找到中医防治新策略。

资料与方法

1 试验试剂、仪器及药物 人NSCLC细胞系A549(中科院上海细胞生物学研究所)。Trizol(赛默飞世尔，USA)、PCR逆转录试剂盒(Fermentas，杭州主诺生物技术有限公司)、BCA试剂盒(碧云天)、荧光定量PCR仪(7500型，ABI公司，USA)、Western blot检测抗体(Abcam，UK)、MTT溶液(天津灏阳生物制品有限公司)、二甲基亚砜(DMSO，北京华美生物工程公司)、酶标仪(赛默飞，USA)、Annexin-V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(上海锐赛生物技术有限公司)、流式细胞仪(FACS Calibur，BD公司，USA)。健脾益肾方各组分中药均由本院制剂部提供。本方选取药物均采用常规水煎法制成并严格按照提取过程进行提取以备用。

2 细胞培养及分组 人NSCLC细胞系A549置于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml 链霉素的RPMI 1640 培养液培养，置于7 ℃、5% CO2的恒温培养箱中。细胞贴壁生长后，使用0.25%胰蛋白酶常规消化传代。取对数生长期的细胞接种至6孔板中，每孔含2 ml DMEM完全培养基。细胞分为四组：空白对照组(仅加入细胞培养液)、阴性对照组(加入细胞，不进行中药处理)、实验组(加细胞加中药处理)进行后续实验。

3 MTT检测细胞增殖 各组细胞转染48 h，调整细胞悬液浓度，制备成单细胞悬液，以每孔1×103个细胞接种于96孔板中，每组设5个复孔，连续培养9 d，每2 d检测活细胞数。待细胞生长至70%融合后，每孔加入20 μl 5 mg/μl的MTT溶液，37 ℃孵育4 h，弃上清液，加入150 μl DMSO，室温摇床振荡10 min，以DMSO调零。各组细胞分别在接种培养24 h、48 h、72 h后，在酶标仪上于492 nm波长处测定各孔吸光度(光密度，OD)值，绘制生长曲线，判断健脾益肾方处理对NSCLC细胞增殖的影响。

4 流式细胞术检测细胞凋亡 分组处理同前。转染后次日，以0.25%胰酶消化细胞，含10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化，1000 r/min下离心机离心5 min，弃上清液。调整细胞浓度为106/ml，按照Annexin-V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒操作步骤进行细胞染色，置于4 ℃冰箱中染色15～30 min。收集各组NSCLC细胞，用Annexin-V-FITC结合液重悬细胞，调整细胞浓度为1×107个/ml，4 ℃下2000 r/min离心10 min后弃去上清，预冷PBS洗涤并再次重悬细胞。加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI染色液混匀，室温避光孵育10 min。随即用流式细胞仪进行检测，激发波长为480 nm，计算并获取细胞凋亡率。细胞凋亡率以凋亡细胞所占细胞总数的百分率表示。

5 荧光定量PCR检测 分组处理同前。转染后次日利用Trizol提取各组细胞总RNA，并测定其浓度、纯度及鉴定其完整性。取2 μg总RNA，按照逆转录试剂盒提供的方法合成cDNA。取10 μl逆转录产物进行PCR反应，反应条件：94 ℃预变性30 s，94 ℃变性45 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸60 s，共35个循环。用ΔCt值法，以GADPH为内参照定量Survivin、Bcl-2和Caspase-3表达水平。

6 Western blot检测 分别取各组处于对数生长期的NSCLC细胞，用预冷PBS洗涤细胞2次，加入1 ml RIPA蛋白裂解液，12000 r/min，离心10 min。吸取上清液采用BCA试剂盒测定总蛋白含量。取20 μg蛋白加样至10%SDS-PAGE凝胶电泳后，后转膜至PVDF，并5%脱脂奶粉室温下封闭1 h。随后，加入兔抗人Survivin、Bcl-2和Caspase-3、兔抗人GADPH，4℃孵育过夜。洗涤后加入山羊抗兔IgG-HRP二抗室温孵育1 h。TBST洗膜后用ECL液显色。应用凝胶图像分析系统进行吸光度扫描，计算目的蛋白表达水平(A目的蛋白/Aβ-actin)。

7 统计学方法 采用SPSS 20.0统计学软件(PSS，Inc，Chicago，IL，USA)。实验均重复3次。计量资料用均数±标准差表示，两组间样本均数比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

结 果

1 健脾益肾方对NSCLC细胞系A549细胞增殖的抑制作用 MTT增殖通过检测各组细胞吸光度值，绘制三组生长曲线结果，见表1。与空白对照组相比，阴性对照组细胞在24、48、72 h的吸光度值明显升高，组间差异显著；而实验组24、48、72 h的吸光度值均显著降低，与空白对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)。同时，随处理时间的延长，吸光度值逐渐增加，各时间段吸光度值比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2 健脾益肾方对NSCLC细胞系A549细胞凋亡的促进作用 见表2。运用流式细胞术Annexin-V-FITC/PI法检测各组细胞凋亡情况。与空白对照组相比，阴性对照组细胞凋亡率下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。而与空白对照组相比，健脾益肾方处理的实验组细胞凋亡率显著上升(P<0.05)。

表1 健脾益肾方对NSCLC细胞系A549细胞增殖的抑制作用 [L/(g·cm)]

注：与空白对照组相比，*P<0.05

3 健脾益肾方对NSCLC细胞系A549细胞Survivin、Bcl-2和Caspase-3 mRNA表达的影响 见表2。运用荧光定量PCR检测不同处理情况下NSCLC细胞系A549细胞Survivin、Bcl-2和Caspase-3 mRNA相对表达量。根据2-△△CT法定量分析结果，与空白对照组相比，阴性对照组Survivin和Bcl-2 mRNA相对表达量上调，Caspase-3 mRNA相对表达量下调，各指标组间差异具有统计学意义(P<0.05)。同时，与空白对照组相比，健脾益肾方处理的实验组Survivin和Bcl-2 mRNA相对表达量下调，Caspase-3 mRNA相对表达量上调(P<0.05)。

表2 健脾益肾方对NSCLC细胞系A549细胞Survivin、Bcl-2和Caspase-3 mRNA表达的影响

注：与空白对照组相比，*P<0.05

4 健脾益肾方对NSCLC细胞系A549细胞Survivin、Bcl-2和Caspase-3蛋白表达的影响 见表3。

表3 健脾益肾方对NSCLC细胞系A549细胞Survivin、Bcl-2和Caspase-3蛋白表达的影响

注：与空白对照组相比，*P<0.05

利用Western blot法检测不同处理情况下NSCLC细胞系A549细胞Survivin、Bcl-2和Caspase-3蛋白相对表达量。结果显示，与空白对照组相比，阴性对照组Survivin和Bcl-2蛋白相对表达量上调，Caspase-3蛋白相对表达量下调，组间比较，差异具有统计学意义(P<0.05)；而健脾益肾方处理的实验组Survivin和Bcl-2蛋白相对表达量下调，Caspase-3蛋白相对表达量上调，与空白对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。

讨 论

目前肺癌已成为我国肿瘤相关死亡率最高的恶性肿瘤之一[6]。细胞增殖凋亡是细胞生命活动的关键特征之一。

本研究通过体外细胞实验探究健脾益肾方对NSCLC细胞体外增殖凋亡作用，发现健脾益肾方可通过下调Survivin和Caspase-3表达诱导NSCLC细胞凋亡，并抑制肿瘤细胞的增殖，进而抑制NSCLC的发展。具体而言，本体内实验通过不同处理方式，将培养A549细胞系分为三组，分别为仅加入细胞培养液的空白对照组，加入细胞，不进行中药处理的阴性对照组，以及加细胞加中药处理的实验组(加细胞加中药处理)。阴性对照组的设立为检测NSCLC细胞中增殖凋亡和相关基因的表达，而实验组以健脾益肾方处理，目的在于探究该组方在改善A549细胞增殖凋亡的功能。结果显示与空白对照组相比，阴性对照组细胞在24 h、48 h、72 h的OD值明显升高，细胞凋亡率下降，Survivin和Bcl-2 mRNA和蛋白相对表达量上调，Caspase-3 mRNA和蛋白相对表达量下调。而健脾益肾方处理的实验组24 h、48 h、72 h的OD值均显著降低，细胞凋亡率显著上升，Survivin和Bcl-2 mRNA和蛋白相对表达量下调，Caspase-3 mRNA和蛋白相对表达量上调，与空白对照组相比差异显著。

健脾益肾方由黄芪、党参、白术、当归、枸杞子、旱莲草、女贞子等组成，根据其组成可知，该药在养气补血、健脾补胃、滋肝补肾等方面效果佳，可用于缓解并改善患者放化疗的毒副作用，从而达到扶正培本的功效[7]。肺癌属中医学“肺积”、“痞癖”、“息贲”等范畴[8]。既往中医药研究已显示，中医配伍在改善患者不良反应、提高生活质量、延长患者生存期等方面具有一定优势[9-11]。值得关注的是，在个体化辨证施治上，中医药配合治疗更具特色，从而有助于显著提高患者临床疗效。中医学解释肺癌发病机制提示，正气虚损，而邪气袭肺，肺脏功能失调，致脉络瘀堵，集结于肺，日久成疾，且正气虚损进一步导致脾胃虚弱[12]。鉴于此，本健脾益肾方的黄芪可健脾和胃、补气升阳，适用于脾胃不和等症；党参可补气健脾，改善脾胃虚弱之症；白术补气健脾，可用于治疗肺脾气虚之症；枸杞子可养肝、滋肾、润肺；女贞子可补益肝等[13-14]。各方配伍，发挥补正气、祛邪气之功效，进而起到抗肿瘤的功能。同时，Survivin、Bcl-2和Caspase-3作为凋亡相关蛋白，可调控并反映肿瘤细胞凋亡[15-17]。本实验发现，NSCLC细胞中Survivin和Bcl-2均为上调表达，提示基因转录功能的增强，发挥抗凋亡作用；而Caspase-3下调表达，抗凋亡作用被抑制。而给予健脾益肾方处理的NSCLC细胞Survivin和Bcl-2表达下调，Caspase-3表达上调，提示健脾益肾方可有助于促进肿瘤细胞凋亡。作为细胞凋亡基因的调控者，Bcl-2是主要的抗凋亡基因[18-19]；Survivin则是Bcl-2调控下的重要凋亡抑制因子，且其通过内源性或外源性途径参与凋亡抑制[20]。Bcl-2表达水平降低时，可诱导Survivin水平的降低，进而启动Caspase级联反应，最终介导细胞凋亡的发生。从中医角度而言，健脾益肾方具有益气散瘀功效，降低Survivin和Bcl-2表达，并促进Caspase-3表达，最终发挥促NSCLC细胞凋亡的作用。

本研究提示健脾益肾方可通过下调Survivin和Caspase-3表达诱导NSCLC细胞凋亡，并抑制肿瘤细胞的增殖，进而抑制NSCLC的发展，有助于加深我们对NSCLC发生和肿瘤细胞生物学特性的了解，并为进一步寻找临床肿瘤早期治疗提供参考。