补肾解毒方调控IL-12、IFN-γ水平对辐射后小鼠免疫防护作用研究*

杜 磊,李延晖,杨云霜,张 蓉△

1.北京市隆福医院治未病科(北京 100010);2.火箭军特色医学中心中医科 (北京 100088)

随着各行业领域对核能的不断开发利用，人们遭受核辐射的潜在风险日益增加，免疫系统是对核辐射损伤最敏感的组织器官。IL-12、IFN-γ是细胞免疫过程中的关键调节因子，IFN-γ不仅具有相关免疫活性,而且可作用于多种参与更新和重建的细胞体系中，影响其分化和形成，二者共同诱导Th0向Th1分化，刺激免疫应答。我们前期研究发现，补肾解毒方能减轻辐射后小鼠脾、胸腺等免疫器官损伤[1-2],基于此，本实验通过检测IL-12、IFN-γ分泌水平的变化，探究此方对辐射后小鼠免疫系统的防护机制。

材料与方法

1 动 物 SPF级C57BL/10J小鼠，8周龄，体质量(25±3) g，南京大学生物医药研究院提供，动物合格证号：[SCXK(苏)2018-0008]。饲养于北京师范大学生命科学院实验动物中心，自由摄食进水。

2 试 药 补肾解毒方颗粒组成：山萸肉12 g，熟地黄、山药、牡丹皮、泽泻、茯苓、白花蛇舌草各10 g,冬虫夏草3 g。由康仁堂药业有限公司制成中药颗粒制剂。将上方颗粒与无菌水混合煎煮，过滤，浓缩滤液配置出浓度为1.38 g/ml药液，分装置4 ℃冰箱保存。IL-12 ELISA试剂盒(规格型号：96T，北京瑞格博科技发展有限公司)，IFN-γ ELISA试剂盒(规格型号：96T，北京瑞格博科技发展有限公司)。

3 仪 器60Coγ-辐射装置(北京伽玛高新有限公司生产，型号：GM-11-03-A),由北京师范大学化学学院提供，高速台式冷冻离心机(上海天美科学仪器有限公司,型号:CT15RT)。

4 分组、造模及给药 90只C57BL/10J小鼠随机分为五组：空白组、辐射组、氨磷汀组、补肾解毒方防治结合组和补肾解毒方预防组,每组18只。防治组与预防组小鼠每日予以补肾解毒方滤液灌胃(0.25 ml/只)，余三组予以等容积生理盐水灌胃，连续给药10 d，第11天，除空白组外所有小鼠接受与照射源等距离的一次性4Gy60Co γ-射线全身照射，同时氨磷汀组小鼠在辐射前30 min内按照200 mg/kg体重常规剂量注射氨磷汀。照射后，防治组继续给予补肾解毒方滤液灌胃，余四组予以等容积生理盐水灌胃,并于辐射后第1、7、14天取材，眼球取血，分离血清，采用ELISA法检测血清中IL-12、IFN-γ水平。

5 血清IL-12、IFN-γ水平测定 血液在室温下自然凝固20 min，放入离心机离心15 min(3000转/ min)，收集上清，应用ELISA法，根据标准曲线的回归方程，计算出小鼠血清IL-12、IFN-γ水平。严格按照试剂盒操作步骤进行。

结 果

1 补肾解毒方对辐射小鼠血清IL-12水平的影响 表1显示，辐射后第1天，氨磷汀组IL-12水平高于辐射组(P<0.05)；辐射后第7天，防治组IL-12水平高于辐射组(P<0.05)；辐射后第14天，各组间无统计学差异。

2 补肾解毒方对辐射小鼠血清IFN-γ水平的影响 表2显示，辐射后第1天、14天，各组间比较无统计学差异；辐射后第7天，防治组IFN-γ水平高于辐射组与氨磷汀组(P<0.01，P<0.05)，同时预防组高于辐射组(P<0.05)，空白组高于辐射组和氨磷汀组(P<0.05)。

表1 补肾解毒方对辐射小鼠血清IL-12水平的影响(ng/L)

注：同时间点各组与辐射组比较，*P<0.05

表2 补肾解毒方对辐射小鼠血清IFN-γ水平的影响(ng/L)

注：同时间点与空白组比较，▲P<0.05；同时间点与辐射组比较，*P<0.05；同时间点与氨磷汀组比较，△P<0.05

讨 论

免疫系统是对辐射高度敏感的靶器官，辐射产生过量自由基，通过能量的大量传递，导致DNA双链结构断裂(Double-strandbreaks,DSBs)和生物大分子损伤,诱导免疫细胞凋亡，对免疫系统造成伤害[3-4]。

IL-12、IFN-γ是由多种细胞产生的低分子量可溶性蛋白质，二者共同促进机体细胞功能彼此协调和发挥效应，具有调节固有免疫和适应性免疫的功能[5]。IL-12为由p35-p40亚单位组成的异质二聚体，国内外研究发现[6-8]，IL-12可调节Th1/Th2平衡，同时增加Th1型因子，如IFN-γ的分泌[9]，是免疫应答过程中的重要调节因子。IFN-γ作为重要的宿主免疫防御环节，功能广泛，Nakanishi等[10-11]发现，它可促进MHC分子表达和抗原提呈，诱导Th1细胞分化，抑制Th2细胞分化。多项动物实验证明[12]：IFN-γ基因敲除小鼠免疫能力弱于正常鼠。故二者在免疫过程中发挥着不可替代的作用。

实验中观察到小鼠受辐射后多有食欲减退、出血、皮肤毛发损害等症状，而临床中的辐射病也多见恶心、呕吐、出血、皮肤烧烫伤、毛发脱落等症状，因此由症状推求病因，可知辐射在中医病因中归类于火热毒邪一类，其特性暴戾猛烈、耗气伤精，易燔灼营血，致肝肾之精血枯竭，治当滋阴填精，清热解毒。补肾解毒方由滋补肾阴经典方六味地黄丸化裁而来，六味地黄丸肝脾肾并补，尤善补肾之真阴，考虑到火热毒邪最易耗伤肾阴根本，故补肾之真阴成为防治辐射后机体的免疫损伤的关键方面[13]。国内外多项研究证明[14-15]，六味地黄丸有促进新陈代谢、调节免疫、抗肿瘤等作用。考虑到熟地滋腻碍胃的特性，在此基础上，我们将熟地减量至10 g，以减轻辐射后胃肠道的负担，并加入冬虫夏草3 g，白花蛇舌草10 g；冬虫夏草首载于《本草从新》，补肾益肺，专补命门，主要活性成分真菌多糖、虫草酸可提高骨髓造血功能，抑制癌细胞分裂[16]，Hwang等[17]研究发现，这些主要活性成分还具有抗氧化、提高免疫力的功能。白花蛇舌草具有清热解毒、利湿通淋之效，参与内皮细胞的增殖凋亡，内含总黄酮成分能促进IL-12、IFN-γ等细胞因子的增多[18]。诸药合用，共奏扶正祛邪之功。

实验结果显示,辐射后第1d，氨磷汀组IL-12水平高于辐射组，各组间IFN-γ水平比较无统计学差异；表明补肾解毒方对辐射急性期IL-12、IFN-γ无明显影响，氨磷汀上调了IL-12水平，表现出防护作用。辐射后第7天，防治组IL-12水平高于辐射组，IFN-γ水平防治组高于辐射组与氨磷汀组，同时预防组高于辐射组，空白组高于辐射组和氨磷汀组，防治组效果最优，预防组次之。表明辐射中期，补肾解毒方能提高IL-12、IFN-γ水平，促进辐射后机体损伤的修复，且辐射后继续给药能发挥最佳防护效果，氨磷汀作为目前最常用的辐射防护剂，目前在临床上仅应用于大量接触射线之前的患者，辐射之后给药则未显现疗效，而中药在辐射前后均能发挥疗效。辐射后第14天，各组IL-12、IFN-γ水平比较无统计学差异，表明了机体自身修复能力，中低剂量照射后，无论是否用药，随着自我修复的启动，各项指标逐渐趋于正常。

综上，补肾解毒方颗粒能提高辐射后小鼠血清中IL-12、IFN-γ的分泌水平，增强机体免疫力，为我们未来进一步发掘此方对辐射后的免疫防护机制奠定了坚实的基础。