紫柏凝胶通过调节ERK及P38/MAPK信号通路下调宫颈癌荷瘤裸鼠E6、E7蛋白表达研究*

温利娟,薛晓鸥,马秀丽,米 鑫,谢 伟

1.北京市顺义区妇幼保健院(北京101300);2.北京中医药大学东直门医院(北京100700)

宫颈癌是女性恶性肿瘤发病率第2位的肿瘤，根据世界卫生组织(WHO)的数据，每年约25万女性死于宫颈癌[1-2]。ERK及P38是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成员，参与了细胞的生长、发育等生理过程，在细胞恶性转化过程中起着关键性作用。目前ERK及 P38信号通路的研究对肿瘤防治工作有重要意义[3]。

名老中医郭志强教授创立了紫草散治疗宫颈HPV感染，经薛晓鸥教授团队剂型优化为紫柏凝胶，前期实验研究表明紫柏凝胶可抑制宫颈癌Siha细胞增殖，促进细胞凋亡[4]。然而，紫柏凝胶治疗宫颈癌的具体机制尚不明确。本实验旨在通过研究建立人宫颈癌裸鼠荷瘤模型，观察ERK及P38/MAPK信号通路在紫柏凝胶影响宫颈癌裸鼠移植瘤致癌蛋白E6、E7 表达中的作用，以期从分子生物学水平为阐明紫柏凝胶治疗宫颈癌作用机制。

材料与方法

1 动 物 35只SPF级BALB/c(nu/nu)雌性裸小鼠，5～6周龄，体质量16～18 g，由维通利华实验动物中心提供(动物合格证号:SCXK(京) 2012-0001)。医学实验动物使用许可证编号：SYXK( 京) 20120028。

2 细胞株 宫颈癌Siha细胞株购自上海复祥生物科技有限公司。

3 药 物 紫柏凝胶由紫草、黄柏、莪术、银花、苦参、百部、儿茶、白及、冰片九味中药组成，药物比例为20∶20∶20∶20∶20∶20∶15∶6∶2，饮片由北京中医药大学附属东直门医院药剂科提供，按工艺提取后制作而成，由北京百川飞虹技术有限公司生产(15 g/瓶，含生药量约2.7 g，批次号：20160501)。注射用顺铂，10 mg/支，齐鲁制药有限公司(生产批号：H37021358)。

4 主要试剂及仪器 抗人乳头瘤病毒16(E7)抗体(英国abcam公司)，山羊抗兔 IgG(英国abcam公司)，山羊抗鼠 IgG(英国abcam公司)，抗人乳头瘤病毒16(E6)，18(E6)抗体(英国abcam公司)，抗p-ERK抗体(英国abcam公司)，抗p-p38抗体(英国abcam公司)，免疫组化试剂盒(北京中衫生物科技有限公司)，倒置显微镜(日本Nikon)，细胞培养箱( 德国Thermo公司)，生物洁净使用超净台(杭州Opti MAIR公司)。

5 Siha细胞悬液制备方法 Siha细胞株复苏→细胞培养→对数生长期细胞→胰酶消化→离心→丢上清→悬浮细胞→细胞计数。培养条件：含10%胎牛血清DMEM液、100 mg/ml浓度的链霉素和青霉素，置于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱内培养。最后调整细胞浓度2×107/ml。

6 模型制备及分组方法 无菌条件下，用0.5 ml注射器抽取0.2 ml(浓度为2×107/ml)Siha细胞悬液，并注射于裸鼠右前肢腋窝。皮下结节直径>0.5 cm为成瘤标准[5]，饲养于SPF环境，观察裸鼠生长状态及肿瘤生长情况。本实验共35只裸鼠成瘤率为100%。成瘤后将裸鼠称重，用随机数字表法分成紫柏凝胶高、中、低剂量组，顺铂组及模型组，每组7只。

7 干预方法 紫柏凝胶各剂量组分别用无菌棉签在瘤体表面涂抹紫柏凝胶0.9428(相当临床剂量的2倍)、0.4714(等同于临床剂量)、0.2357(相当于临床剂量的1/2)g/kg，1 d/次；顺铂组腹腔内注射0.5 ml顺铂5 mg/kg，相当于临床化疗方案中 100 mg /(m2·d)用量，4 d/次；模型组不干预。各组均干预4周。

8 观察指标

8.1 一般观察指标:包括裸鼠精神状态、反应力、活动力、饮食情况，同时包含抑制瘤皮下种植区外观及触感。治疗过程中死亡裸鼠均行解剖以明确死因。

8.2 裸鼠体质量及瘤体体积:测量每日用药前裸鼠体质量，并测量裸鼠瘤体的长径(a)和短径(b)，计算肿瘤体积(V)，V=ab2/2。

8.3 瘤重及抑瘤率检测:停药24 h后，颈椎脱臼法处死裸鼠，完整剥取瘤组织，测量体积并称瘤重。抑瘤率(%)：[(对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重]×100%。

8.4 瘤体组织病理学观察:采用HE染色法。常规石蜡包埋，切片厚度4 μm，二甲苯去蜡处理，乙醇及蒸馏水清洗切片，苏木精液染色，流水及蒸馏水冲洗。0.5%伊红液染色，乙醇清洗。中性树胶封固[6]。

8.5 免疫组化法检测瘤组织中E6、E7、p-ERK和p-p38蛋白表达:采用免疫组化SP法，第1天行组织切片，脱蜡，灭活，热修复抗原处理，室温内静置冷却，PBS清洗；滴加5%BSA封闭液室温放置；滴加一抗后切片放置于4 ℃冰箱过夜[7]。第2天清洗后滴加二抗，室温放置后清洗，滴加SABC，室温放置后清洗，DAB室温显色后中止反应，苏木素轻度复染后中止反应，切片放入酒精中，中性树胶封片。

9 判定标准 免疫组化法检测下p-ERK、p-p38、E6和E7蛋白表达水平，结果判读采用人工计数方法，即根据染色强度和阳性细胞的比例评分。所有切片的观察经三名研究人员独立在光镜下完成，随机选择高倍视野共10个，计算的阳性细胞比例；>75记4分；50%～75%记3分；25%～50%记2分；5%～25%记1分；<5%记0分。染色强度：棕褐色为3分；棕黄色为2分；浅黄色或黄色为1分；无显色为0分。蛋白表达水平=染色强度×阳性细胞比例。光镜下以上各蛋白阳性细胞表现为细胞膜或细胞浆呈棕黄色[8]。

结 果

1 各组裸鼠一般状态比较 Siha细胞接种后，2 d裸鼠皮肤种植区呈白色，5～6 d种植区皮下可触及2～3 mm结节，质韧，7～8 d结节直径达5 mm，质地略硬。顺铂组裸鼠在7 d出现饮食量及活动量明显减少，形体消瘦，该组2只裸鼠分别治疗在17、18 d死亡，解剖肝肾等内脏未见明显异常，考虑为化疗不良反应致死。其余各组裸鼠无明显消瘦，无死亡。

2 各组裸鼠瘤重及抑瘤率比较 见表1。 与模型组比较，顺铂组及紫柏凝胶高、中剂量组瘤重降低(P<0.05)。与顺铂组比较，各剂量紫柏凝胶组瘤重升高(P<0.05)，抑瘤率降低(P<0.05)。与低剂量紫柏凝胶组比较，中、高剂量紫柏凝胶组瘤重降低(P<0.05)，抑瘤率升高(P<0.05)。

3 各组裸鼠移植瘤组织肉眼及镜下观察 肉眼观察，移植瘤组织呈结节状，切面呈鱼肉样，伴见局灶性坏死。显微镜下观察肿瘤细胞呈簇团状、漩涡状生长，细胞呈卵圆形或圆形，核大，见病理性核分裂，细胞核染色加深，见核固缩、溶解、碎裂瘤团间可见坏死病灶形成，呈均质红染色样。顺铂组肿瘤组织坏死区域增大较为明显，紫柏凝胶各剂量组肿瘤组织坏死区域面积与剂量呈正比关系(图1)。

表1 各组裸鼠瘤重及抑瘤率比较

注：与模型组比较， *P<0.05；与顺铂组比较，△P<0.05；与低剂量紫柏凝胶组比较，▲P<0.05

A：模型组；B：紫柏凝胶低剂量组；C：紫柏凝胶中剂量组；D：紫柏凝胶高剂量组； E：为顺铂组。箭头所指为肿瘤坏死细胞

4 紫柏凝胶对E6、E7蛋白表达的影响 见表2、3。 与模型组比较，中剂量、高剂量紫柏凝胶组及顺铂组E6蛋白表达均明显降低(P<0.05)，高剂量紫柏凝胶组及顺铂组E7蛋白表达均明显降低(P<0.05)；与顺铂组相比，紫柏凝胶各组E6表达上升(P<0.05)，紫柏凝胶各组E7表达上升(P<0.05)；与低剂量紫柏凝胶组比较，中、高剂量紫柏凝胶组E6蛋白表达均明显降低(P<0.05)，中、高剂量紫柏凝胶组E7蛋白表达均明显降低(P<0.05)。提示紫柏凝胶有下调E6、E7蛋白表达的作用(图2)。

5 紫柏凝胶对ERK及P38/MAPK信号相关蛋白表达的影响 见表2、3。

表2 各组平均阳性细胞染色强度比较(分)

注：与模型组比较， *P<0.05；与顺铂组比较，▲P<0.05；与低剂量紫柏凝胶组比较，△P<0.05

表3 各组E6、E7、p-ERK、p-p38蛋白表达比较(分)

注：与模型组比较，*P<0.05；与顺铂组比较，▲P<0.05；与低剂量紫柏凝胶组比较，△P<0.05

与模型组比较，中、高剂量紫柏凝胶组及顺铂组p-ERK及p-p38蛋白表达均明显下降(P<0.05)；与顺铂组比，紫柏凝胶各组p-ERK及p-p38蛋白表达上升(P<0.05)；与低剂量紫柏凝胶组比较，中、高剂量组及顺铂组蛋白表达均明显下降(P<0.05)。提示紫柏凝胶有下调p-ERK及p-p38蛋白表达的作用(图2)。

A：紫柏凝胶高剂量组；B：紫柏凝胶中剂量组；C：紫柏凝胶低剂量组；D：为模型组； 1：E6蛋白； 2： E7蛋白； 3：p-ERK蛋白； 4：p-p38蛋白；箭头所指为蛋白表达

图2 各组裸鼠E6、E7、p-ERK、p-p38免疫组化染色蛋白表达结果(免疫组化染色，×200)

讨 论

中医古籍并无“宫颈癌”这一病名，其属于中医“崩漏”及“癥瘕病”疾病[9]，名老中医郭志强教授认为该病的主要病机是正气邪盛，邪毒瘀阻于胞中[10]。在宫颈癌患者手术、放化疗中，采用中医四诊合参，辨证论治后治以扶正祛邪，中医方法的干预，可有效改善宫颈癌患者生活质量，延长生存期，降低患者放化疗治疗的毒副作用，具有减毒增效之优势[11]。郭志强教授认为应在感受湿热之邪早期针对宫颈HPV感染治以清热利湿，解毒杀虫，并选用清热利湿法，并创立了紫草散，全方以紫草为君药，以金银花、苦参、黄柏、莪术为臣药，佐以白及、百部及冰片，以儿茶为使[12]。前期研究表明紫柏凝胶具有抑制宫颈癌Siha细胞增值，促进癌细胞凋亡的作用[13]。然而其抑癌的具体机制尚不明确，并未得到更进一步的阐明。

研究证实，HR-HPV基因由3个部分组成：早期区，晚期区，长控制区。早期区(Early region，E)含E1至E7共6个基因，HR-HPV其致癌机理主要与 E6、E7 蛋白有关。 E7 与成视网膜细胞瘤(Rb)肿瘤抑制蛋白结合，导致蛋白降解；而E6 与 p53 结合，促进细胞增殖，减少细胞凋亡[14]。ERK及p38参与了细胞的生长、发育等生理过程。ERK及p38 是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)在细胞恶性转化过程中起着关键性作用，ERK及p38信号通路的研究对肿瘤防治工作有重要意义[15]。

本研究采用动物实验方法，通过建立Siha(+)宫颈癌荷瘤裸鼠模型，研究各剂量组紫柏凝胶治疗宫颈癌疗效及优势，阴性对照组选用模型组，阳性对照组选用顺铂组，研究结果显示紫柏凝胶各组对宫颈癌荷瘤裸鼠移植瘤的生长均有不同程度的抑制作用。高、中、低剂量组的肿瘤抑制率分别为36.23%、31.24%及14.94%。研究结果表明：紫柏凝胶可下调致癌蛋白E6和E7的表达，同时阻断ERK及p38/MAPK信号通路，下调p-ERK、p-p38蛋白的表达。ERK及P38/MAPK信号通路未必是紫柏凝胶抑制肿瘤、影响癌蛋白表达的全部内容，此过程还有哪些通路的参与尚需进一步实验研究证明。