改良法制备冰冻解冻去甘油红细胞技术的应用〔1〕

张秀华，邱新璐，赖建秀，康美艳，何燕琴

(赣州市中心血站，江西 赣州 341000)

RH(-)血型属稀有血型，约占3%，目前普通悬浮红细胞在2～6 ℃保存时间最长为35 d[1]。冰冻红细胞保存技术主要用于RH(-)血液，以节约血液资源，同时确保临床RH(-)患者应急输用[2]。冰冻红细胞保存技术主要使用复方甘油保护剂，而如何快速解冻并最大程度去除冰冻红细胞中甘油、上清血红蛋白含量成分，减少解冻去甘油过程对红细胞的损耗，有效提高红细胞的回收率或血红蛋白含量，保障产品质量的稳定性，对临床RH(-)血型急救患者及时有效的血液输注、成功抢救患者生命具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 设备与材料

起始血液：保存6 d内的去白悬浮红细胞；选用设备：BBS926全自动医用低速离心机、摇摆机。

1.2 改进前存在的缺点

用南格尔BBS926全自动医用低速离心机制备冰冻解冻去甘油红细胞所需时间长，红细胞回收率低，甘油残留率和上清血红蛋白残留量高。

1.3 方法

2014年7月—2016年6月我站进行实验，于技术改良前、技术改良后分两组制备共30袋，原始血液为6 d内的去白悬浮红细胞的冰冻解冻去甘油红细胞产品，将其分为改良组和原始组，每组15 袋。通过检测解冻红细胞压积，用于机器自动洗涤去甘油时依次用9%NaCl，9%NaCl加0.9%NaCl，0.9%NaCl进行递度稀释细胞内外甘油浓度。改良组制备技术：对南格尔型号为BBS926自动医用低速离心机进行程序改进，将加甘油后保留所有甘油成分进行冰冻的程序改良为离心去除己甘油化红细胞中上清成分的100 mL。原始组则在改进前制备，制备方法按照设备厂家最初设定的程序进行。

1.4 观察指标

按照《全血及成分血质量要求》(GB18469-2012)中的检测方法[3]，对两组终产品的游离血红蛋白含量、甘油残留量、血小板残留量以及白细胞残留量进行检测，并记录两组制备时间。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 两组终产品各指标的比较

两组终产品各指标的检测结果显示：原始组各项指标均满足国家标准范围，证明原始方法所制备的终产品合格。技术改良后，改良组终产品红细胞回收率明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，终产品上清游离血红蛋白含量、甘油残留量、血小板残留量以及白细胞残留量四项指标比原始组明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。以上指标在符合国家标准的基础上，进一步提升了血液输注的安全性(见表1)。

2.2 两组制备1 U时冰冻及溶解时间比较

制备1 U时，改良组下降至0 ℃和-50 ℃所需时间及溶解时间均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)(见表2)。

表1 两组终产品各指标的比较

表2 两组制备1 U时的冰冻时间及溶解时间比较

2.3 两组制备2 U时冰冻及溶解时间比较

制备2 U时，改良组下降至0 ℃和-50 ℃所需要时间以及溶解时间均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)(见表3)。

表3 两组制备2 U时冰冻及溶解时间比较

3 讨 论

RH(-)血液稀少，为满足临床RH(-)患者输血的需要，血站常需要库存一定量的RH(-)血液[4]。但是临床需要RH(-)血型的人员不定或偶有突发事件时需要量超出库存数量，如果临时去采集RH(-)血型的血液，招募、采血、检测等过程会花费较长时间，对于临床上需要等血救命的患者来说很不利[5]。近年来，我国临床上对治疗用血液的需求量逐年增加，国内研究指出[6]，血液的使用量在许多三甲医院中逐年增多，具有RH(-)阴性血型的人群在我国占比较少，以人数最多的汉族为例，其中RH(-)血型比例也仅仅只占0.3%～0.5%。因此，为满足上述需求，提高临床治疗效率以及需求量，利用技术将RH(-)血液进行长期保存，对于目前医疗水平而言是最理想的方法。

为了能给临床RH(-)患者在最短的时间内输注安全的血液，我站一直采用南格尔BBS926全自动医用低速离心机制备冰冻解冻去甘油红细胞技术，但遇到应急、突发状况时仍存在问题。基于此，我站在手工制备冰冻解冻去甘油的基础上，引进全自动低速离心机，并进行程序改良：将加甘油后保留所有甘油成分进行冰冻的程序改良为离心去除己甘油化红细胞中上清成分100 mL，提高冰冻红细胞保存时的冷冻速率，减少解冻时的融化时间，从而减少红细胞冰冻解冻过程的损耗。两组终产品各指标的检测结果显示：原始组各项指标均符合国家标准，证明原始方法所制备的终产品合格。技术改良后，改良组终产品红细胞回收率比原始组明显升高(P<0.05)，上清游离血红蛋白含量、甘油残留量、血小板残留量以及白细胞残留量四项指标比原始组明显下降，差异具有统计学意义(P<0.05)，以上指标在符合国家标准的基础上，进一步提升了血液输注安全性。甘油在冰冻保存红细胞时，是一种天然的细胞内低温保护剂，对于红细胞冰冻、解冻时起保护作用[7]。人体红细胞在低温下会产生大量冰晶，对红细胞的细胞膜可能产生机械性损伤，且低温引起的渗透压变化也可能使红细胞内受到化学损伤[8]，甘油对以上两种损伤都存在保护作用，且刘晓洋等[9]研究指出，甘油同时还可提高红细胞回收率，应用极为广泛。但这些红细胞在投入临床应用时，甘油必须经过洗涤处理[10]，达到国标所规定的残留量(<10 g/L)。我站在实际使用中发现，机器洗涤有时也会存在接近于10 g/L的残留量，因此提出了改进方法。而对于游离血红蛋白、血小板以及白细胞而言，这三项指标是在红细胞投入临床输血应用时引起患者机体不良或过敏反应的主要因素，需严格控制其在终产品中的含量，原始的机器法可达到较为理想的残留量水平，但我站经过改良后，以上三种物质含量均进一步下降。此外，本次研究结果还显示：制备1 U和制备2 U时，改良组下降至0 ℃和-50 ℃所需时间及溶解时间均低于原始组，差异具有统计学意义(P<0.05)。机器制备法虽相对于传统的手工制备法在效率、质量上存在一定优势，但其在材料资源消耗、制备成本方面存在一定劣势[11]，这使得提高机器制备法的效率显得尤为重要。本次改良后的制备程序可有效提高冰冻红细胞保存时的冷冻速率，减少解冻时融化时间，从而在减少红细胞冰冻解冻过程损耗的同时，缩短了制备时间，提高了效率。

综上所述，通过开展冰冻解冻去甘油红细胞改良制备方法，缩短了冰冻解冻去甘油红细胞的制备时间，提高了产品红细胞回收率，进一步降低了甘油残留率及上清血红蛋白残留量，使产品质量保持持续稳定。